某公司内部的操作流程.pdf

Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 未来的中国科学家们，加油！ Genloci Classic CRISPR-Cas9 内 部操作流程 Protocol No. PT140726-1 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 1，CRISPR-Cas9 基因编辑实验流程图如下： ～20bp 5 ’- CACC G -3 ’ - CAAA -5 ’ 1 3 ’ 设计 2 条单链 oligo 序列；退 火形成双链 DNA 。 U6 2 将双链 DNA 连接到载体中。 pGK1.1 3 转化 G10 Competent Cell ；筛 选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。 4 在细胞内 crRNA 识别靶位点， Cas9 对靶位点进行随机剪切。 5 CruiserTM 酶切细胞池，计算突变 率； CruiserTM 酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列 比对分析。 Protocol No. PT140726-1 Genloci Classic CRISPR-Cas9 内部操作流程 2 ，操作步骤 实验前，请您务必做好以下验证实验： A ．单 细胞生长情况，确保单个细胞可以正常生长形成单克隆，即，低密度的细胞在培养皿中可 以形成单克隆。 B ． 目的基因的表达情况分析， 为防止因染色体缺失等情况导致靶基因缺失， 首先需要 PCR 扩增 靶基因，并对 PCR 结果进行测序，确保靶基因的完整存在；其次，您还可以用 RT-PCR 分 析靶基因的活跃度。 1. 设计 Oligo DNA 序列 首先，您需要在靶标 DNA 区域中设计一对 20bp 左右的 oligo DNA ，您可以通过以下在线工具设计： ●麻省理工学院的 CRISPR Design ：/ ●德国癌症研究中心的 E-Crisp ：/E-CRISP/designcrispr 下面我们选择麻省理工学院的 CRISPR Design 工具来做设计举例， 以 Fut 8 基因为例，一次只能输入 大小为 23 ～ 250bp 的基因片段，最好一次只输入一个外显子，避免 Guide 序列跨内含子的。 点击“ Download as genbank ”按钮，出现以下界面：“ Fut8 ” 根据左边的 score 的高低选取合适的 Guide 序列，以 Guide#1 序列为例， 2 条单链 oligo 的序列如下 （红色字体部分是要与 Bbs I 酶切后的载体相互补的部分） ： Fut8-F: cacc GAATGAGCATAATCCAACGCC Fut8-