想做LncRNA与蛋白互作?RNA PULL DOWN技术了解一下.docVIP

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想做LncRNA与蛋白互作?RNA PULL DOWN技术了解一下 转载请注明:解螺旋·临床医生科研成长平台 LncRNA是一类大于200nt的非编码RNA分子,在个体发育和疾病进程中都发挥了重要的作用。近年来,LncRNA的研究重点已经从早期的大规模鉴定,转移到了对具体的某个LncRNA的功能和机制的探索。 LncRNA主要通过与其他分子相互作用发挥功能,包括RNA,DNA和蛋白。其中,LncRNA与蛋白的互作是近几年的研究热点,小又今天给大家介绍的就是研究RNA与蛋白互作的方法——RNA pull down。 进入正题之前,先通过一篇Nature Communications的文章“The LINC01138 drives malignancies via activating arginine methyltransferase 5 in hepatocellularcarcinoma”回顾一下LncRNA在疾病体系中的研究套路:1选中一个LncRNA 通过高通量的方法(包括自己测序以及挖别人的数据)筛选到一批LncRNA,然后选一个最特别的(包括变化最明显,表达量最高或最低,以及目前没有相关研究等),在疾病中利用qPCR验证它的表达情况(包括癌与正常样品,癌与癌旁以及初诊和缓解,初诊和复发等),并做临床预后分析(包括与疾病分型,危险度划分,生存时间等的相关性),妥妥凑到figure1a-g! 比如我们今天要分析的这篇文章,研究者通过对58对肝癌癌组织和癌旁组织的DNA测序分析,发现有53个LncRNA存在基因拷贝数的改变(CNA),然后结合TCGA中的数据,发现有1082个LncRNA的表达量发生了2倍的变化,两组数据取交集,最终得到4个LncRNA,它们的基因拷贝数增加,并且表达上升,说明这4个LncRNA的高表达是由于基因拷贝数增加引起的。 然后选中LINC01138进行下一步分析,因为它的CNA变化最明显。经过qPCR的验证,LINC01138确实在癌组织中高表达,并且与肿瘤大小和生存时间相关。2做表型 LncRNA的表达情况只能说明它有可能在疾病中发挥作用,并不是实锤,所以还需要在细胞水平做表型实验的验证,包括在敲低和过表达该长非编码RNA的情况下,检测细胞的增殖(CCK8,EDU,克隆形成等),周期,凋亡,转移和侵袭。 一个细胞系的图显得单调并且缺乏说服力(除非该疾病比较特殊,只有一种常用的细胞系),需要多做几个细胞系,这个基本没有上限,但是下限是2个细胞系。 做完细胞表型,有条件的话要做动物实验(肿瘤大小的照片,肿瘤体积和重量的统计,小鼠的生存时间曲线等)。只要图够多,凑够2个figure不是问题!在这篇文章中,研究者在两个肝癌的细胞系中,通过敲低和过表达LINC01138做了以下实验。以下图片可能引起不适,请注意!(如何充分利用小鼠展示结果,请参考下图)3搞机制 这是研究的难点。想知道LINC01138是通过结合了什么蛋白,发挥了癌基因的作用,就需要用到今天的重点讲解的技术——RNA pull down技术! 这个技术听上去很魔幻,其实就是富集某个具体的长非编码RNA,然后分析它所结合的蛋白质。 主要实验分为2步:(以下是简化的示意图)1. 富集该LncRNA 都需要用到磁珠,那么磁珠(beads)如何识别该LncRNA呢?介于目前使用的磁珠大多是链霉亲和素,而链霉亲和素可以有效的识别和结合生物素,所以我们的问题进一步细化成该LncRNA如何被链霉亲和素识别以及如何带上生物素标记。 有3种方法: 1.1 探针法 针对该LncRNA的序列,设计生物素标记的探针。目前已经商业化,大家可以咨询相关公司。 要注意的是,探针的特异性在很大程度上决定了实验的成功与否,所以一定要找靠谱的公司,有条件的最好用Northern Blot检测探针的特异性。 探针法最大的优势是可以结合内源的LncRNA。缺点是比较贵,需要的样品量(细胞数)大。 1.2 生物素标记法 如果该LncRNA的丰度较低,或者样品有限,可以考虑体外合成该LncRNA。在LncRNA的5‘端加上T7启动子,利用体外转录试剂盒,可以制备大量的LncRNA。再通过生物素标记试剂盒,就能得到大量的生物素标记的LncRNA。常用的折叠的方法退火,从95℃退火到4℃,大约30秒一度就可以了。 1.3 TRSA法 除了生物素,链霉亲和素还可以识别TRSA结构,因此在LncRNA的一端加上TRSA序列也是不错的选择,还省去了购买生物素标记试剂盒的钱。TRSA是一段人工合成的不到200bp的片段,具体序列大家可以参考这篇文章。2. 蛋白分析 将得到的LncRNA与细胞裂解液孵育一定时间,使长非结合相应的蛋白,再用链霉亲和素磁珠结合带标记的LncRNA,就能得到与

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