Micro-RNA原理及研究策略.pdfVIP

miRNA是近年来在多种真核细胞及病毒中发现的一类内源性染色体上的非 编码单链RNA,miRNA调节了细胞生长，组织分化，最近的研究表明miRNA 参 与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖 和凋亡、脂肪代谢等等，与生命过程中发育、疾病有关。因而对于miRNA 的研 究已经成为热点。 miRNA是一种小的，类似于siRNA 的分子，由高等真核生物基因组编码， miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体 （RISC）降解mRNA 或阻 碍其翻译。 miRNA和siRNA 的区别与联系： 区别： 联系：1.均为Dicer 的产物：长度均为22nt左右，5＇端是磷酸基，3＇端是羟基 2.沉默机制有重叠，均需Argonaute 家族蛋白的存在，同为RISC 的组分 3.二者进化关系上可能的两种推论：siRNA是miRNA 的补充；miRNA在 进化过程中替代了siRNA。 miRNA命名规则： 1.miRNA 简写成miR，根据其被克隆的先后顺序加上阿拉伯数字，如miR-21； 2.高度同源的miRNA在数字后加上英文小写字母(a,b,c……)，如miR-199a 和 miR-199b； 3.不同染色体上的DNA序列转录加工而成的具有相同成熟体序列的miRNA，在 后面加上阿拉伯数字以区分, 如miR-199a-1和miR-199a-2； 4.如果一个前体的2个臂分别加工产生miRNA，在表达水平较低的miRNA 后面 加 “*”，如miR-199a和miR-199a*，或miR-142-5p(也可命名为miR-142-s，表示 从5 端的臂加工而来)和miR-142-3p(也可命名为miR-142-as，表示从3端的臂加 工而来)； 5.将物种缩写置于miRNA之前，如人类miRNA:hsa-miR-195； 6.确定命名规则之前发现的miRNA，如let-7，则保留原来名字。 miRNA在基因组中的形式 miRNA 的作用过程： 1.首先是细胞核中miRNA 的转录：细胞核内编码miRNA 的基因在RNA 聚合酶 Ⅱ的作用下转录成pri-microRNA(primiRNA)，即初级转录本。 2.pre-miRNA 的出核转运：pri-miRNA在一种 DroshaRNasel 的作用下，剪切为 约70个核苷酸长度，具有茎环结构的miRNA 前体(pre-miRNA)。 3.细胞质中miRNA的成熟：pre-miRNA被运送到细胞质后，其双链首先被Dicer 识 别。Dicer对茎环前体一端5’磷 酸，一端3’端两个悬垂的结构有特殊亲和力， 在其作用下，miRNA 前体被剪切成21～25 个核苷酸长度的双链miRNA，成熟 miRNA与其互补序列互相结合成miRNA：miRNA*双螺旋结构(miRNA*是miRNA 的互补序列)；在解旋酶的作用下双螺旋解旋，其中一条结合到RNA诱导的基因 沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex，RISC)上，形成非对称RISC 复合物 (asymmetricRISCassembly)，而另一条却立即被降解。如下图： miRNA表达载体构建： 以 形式构建：最原始的是 ，长度大约为 个碱基。 1. pri-miRNA pri-miRNA 300-1000 Pri-miRNA 的部分序列，大约 左右，构建到含有巨细胞病毒 ， 等启动子的 400bp (cytomegalovirus CMV) 载体上，不需要起始序列、终止序列等元件就可以完成。 以 形式构建：以 形式构建 的表达载体是应用最早，也是最 2. pre-miRNA pre-miRNA miRNA 广泛的构建形式，目前很多商业化的miRNA库都是以pre-miRNA形式构建的。pre-miRNA大 约 ，因为要形成茎环结构，所以必须构建到含有 或 启动子的载体上。 70bp H1 U6 以