QIAGEN Plasmid Midi Kits(亲笔翻译中文版).docVIP

QIAGEN Plasmid Midi Kits 实验前准备： 使用前将RNase A 加入到Buffer P1。 检查Buffer P2 中SDS 是否有析出，如果有在37℃水浴下溶解。 Buffer P3在4℃预冷。 选择：将Lyseblue 加入到Buffer P1，使用前混匀。 实验操作： 从新鲜的选择培养基上挑取单菌落，在含有抗性的2-5ml的LB培养基上培养。培养约8h，37℃，摇床转速约300rpm。 ——摇菌管的体积至少为培养物体积的4倍。 按1/500或者1/1000的比例用选择性LB培养基稀释培养液。对于低拷贝质粒，100ml培养基加入100-200ul起始培养液。培养约12h-16h，37℃，摇床转速约300rpm。 收获菌：4℃，离心15min，离心力6000*g。 用4ml Buffer P1 重悬菌体。 ——如果加入lyseblue，使用前充分混合buffer P1。 ——为了有效的裂解菌体，需使用足够大的容器，以使lysis buffer 从分混合。 ——必需使菌体彻底重悬。 加入4ml buffer P2，迅速翻转管4-6次，室温下（15-25℃）静置5min。 ——不能使用漩涡震荡，以免剪断基因组DNA。 ——溶解液应当呈现出澄清。 ——不能让溶解反应超过5min。 ——使用完毕，buffer P2 需立即盖上盖子，防止空气中的二氧化碳酸化。 ——如果buffer P1中加入 lyseblue。加入buffer P2 后，细胞悬液会立即变蓝。混合后，会产生均一颜色的重悬液。如果悬液包含局部颜色区域或者褐色细胞团，需继续混匀混合液，直到产生均一颜色。 加入4ml预冷的 buffer P3，立即混匀并彻底用力翻转4-6次，冰上孵育15min。 ——加入4℃预冷的buffer P3且冰上孵育后，析出加强。 ——加入buffer P3后，形成白色沉淀，溶菌产物透视度降低。析出物中包括基因组DNA、蛋白、细胞破碎物和KDS。 ——如果加入了lyseblue，悬液需要混合直到蓝色消失，变成无色。均一的无色悬液表明SDS有效的析出。 4℃下，离心30min，离心力≥20,000*g，迅速将含有质粒的上清转移到新的离心管。 ——离心前，样品应重新混合。需在非玻璃试管中离心。 ——离心后重悬液应澄清。 将上清4℃下，再次离心15min，离心力≥20,000*g 。迅速将含有质粒的上清转移到新的离心管。 ——第二次离心应保证沉淀没有进入下一步的QIAGEN-tip。 ——取240ul样品保存（sample1），进行电泳，以确定生长和溶解条件是否优化。 用4ml buffer QBT 平衡柱子，在重力下柱子排空。 ——由于 buffer QRT 中存在去垢剂能减少柱子表面张力，所以buffer能自动留下来。 ——等待buffer QRT 完全流干。 把第八步中的上清加入到 QIAGEN-tip，使其在重力下进入树脂。 ——上清需要迅速转移到QIAGEN-tip，如果放置时间过长，并且变得不澄清，需重新离心。 ——取240ul 流出液保存（sample 2），进行电泳分析.以确定质粒是否有效地结合到QIAGEN-tip上。 11.用2×10ml的buffer QC 洗脱 QIAGEN-tip。 ——Buffer QC 在重力的作用下流过QIAGEN-tip。 ——大部分杂质在第一次洗脱下被去除，当培养物体积过大或者细菌代谢产生大量碳水化合物时非常需要第二次洗脱。 ——取400ul 样品（sample 3），进行电泳分析。 12.用5ml Buffer QF 洗脱DNA。 ——用50ml或15ml收集管（不在试剂盒中）收集洗脱液。 ——不建议使用聚碳酸酯离心管，因为聚碳酸酯不适用下面步骤中使用的乙醇。 ——取100ul样品（sample 4），进行电泳分析。 加入3.5ml（0.7倍）室温的异丙醇来洗提DNA。混合后立即离心，4℃、30min、15,000*g。仔细的移除上清。 ——所有试剂都保持室温，以减少盐析，而4℃离心是为了防止样品过热。 ——也可以选择，使用一次性的圆锥底离心管离心60min、4℃、离心力5,000*g。 ——异丙醇pellet 呈透明状，比蓬松的、乙醇盐析的pellet更难看见。离心前在离心管外标记，使pellet更容易定位。 ——异丙醇pellet与离心管结合较松，移除上清时应当小心。 用2ml 室温下70%的乙醇洗DNA pellet，离心10min，离心力≥15,000g，小心移除上清，不要触动pellet。 ——也可以选择，一次性锥底离心管，4℃下5,000*g离心60min。70%乙醇除去析出的盐，用更易挥发的乙醇代替异丙醇。 风干pellet 5--15min，溶解到合适体积的超