临床色谱质谱检验技术：第五章 液相色谱质谱技术（五）.pptVIP

许多激素具有相似的化学结构，因此对方法的选择性（或者特异性）要求高。 免疫法测定女性和儿童总睾酮经常出现矛盾的结果，由于抗体交叉反应影响诊断的准确性。 对于某些复杂的疾病，由于代谢通路障碍，影响该通路上多种激素，需同时测定多个激素，比如先天性肾上腺皮质增生症（CAH）的诊断，可能需要同时检测17-羟孕酮、11-脱氧皮质醇、雄烯二酮、皮质醇等一系列的激素，才能对CAH代谢障碍的具体类型准确区分。 临床背景、意义 临床背景、意义 有些激素含量低，仅为pmol/L浓度的数量级，LC-MS能准确测定。 儿童、男性、绝经及芳香酶抑制剂治疗的妇女体内雌二醇水平很低，直接免疫法无法准确检测结果，LC-MS能准确测定（SPE富集处理）。 2013年，临床内分泌与代谢杂志（Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism）的主编发表社论要求以后投稿的有关性激素的研究论文必须是基于质谱检测的数据，这样才能获得可靠的结果。 检测方法 前处理方法 衍生化：甲基叔丁基醚（MTBE）提取，为提高离子化效率，上清液吹干后加入羟胺与类固醇激素中的羰进行衍生化反应后进行检测 蛋白沉淀 固相萃取 检测方法 质谱条件 API 4000+ ESI（+） MRM 色谱条件 色谱柱：C18，2.1*100 mm，2.6 μm 流动相：甲醇、水（0.1%甲酸） 梯度洗脱 检测方法 三、小节与思考 《临床色谱质谱检验技术》 液相色谱质谱联用技术 液相色谱质谱联用仪的组成及工作原理 液相色谱质谱联用方法建立的流程及主要考察因素 液相色谱质谱联用技术临床应用的要求 液相色谱质谱联用技术临床应用 Thanks ESI源适合极性化合物，热不稳定化合物。APCI源适合极性弱，难电离的化合物，有一定挥发性。25OHD属于脂溶性化合物，缺乏易电离的基团，25OHD2 或25OHD3本身在ESI离子化方式下很难被电离，不过为了让分析物形成[M+H]+，一般在流动相中加入0.1%的甲酸。 * * * * 扫描方式有几种？各有什么样的特点，如MRM是Q1选择性扫描，Q3是选择性扫描。 * 根据上一步确定的母离子进行Product Scan，确保所有碎片离子都来自待测化合物，而不是溶液中的杂质，找出较强的碎片离子信息。 改变CE，从中选定MRM需要测定的一对或更多离子对，先多选几个离子对，待出现基质干扰时可换，最后根据要求确定离子对数目 * * 其他的一些代谢产物，组分较多，使用封尾柱改善峰形，特别是对于碱性化合物，改善与硅醇基的保留。 * 流动相中尽量避免使用不挥发性的盐（如硫酸盐、磷酸盐以及含氯的缓冲液等）,以及避免使用表面活性剂和离子对试剂，如十二烷基硫酸钠。常用挥发性添加剂：如甲酸、乙酸、乙酸铵、甲酸铵 * 内标的选择：①稳定同位素标记化合物：最理想的内标；②结构类似物。 要求：（1）检测过程中唯一存在的化合物（如它不应该是一种内源性或外源性化合物） （2）内标不能与测试样本中其他具有共同碎片离子的干扰化合物一起被洗脱出来 （3）内标需与待测分析物具有类似的理化性质、质谱行为和响应特征 （4）将潜在离子增强或抑制而产生的峰分离所造成的影响降到最低。 （5）内标物纯度、浓度，不能发生反应…… * * * SPE柱：具有亲水、亲脂的特性，可转化为96孔微孔板批量处理，每批次同时处理96个。 * * * * * /ChromGall/html/5cec9eb99149b6f9.html * 2016.04.26 《临床色谱质谱检验技术》 《临床色谱质谱检验技术》 主要内容 二、小结与思考 一、液相色谱质谱联用技术的临床应用 应用举例Ⅰ：LC-MS/MS应用于维生素D检测 《临床色谱质谱检验技术》 液相色谱质谱联用方法建立 化合物性质 离子化模式——ESI or APCI 化合物 溶解性及极性 分子式 MW 25OHD2 非极性、脂溶性 C28H44O2 412.65 25OHD3 非极性、脂溶性 ?C27H44O2 400.64 ESI与APCI比较 ESI与APCI比较 Max：8.4e5 Max：1.3e5 ESI与APCI比较 寻找母离子 标准溶液进样，Q1 Scan 察看存在哪些离子，要能够看到待测的母离子，应明显比周围的噪声离子高，通过改变DP，观察离子的增减 Pos方式，看M+1，M+18，M+23等等，初步判断分子离子，如看不到则可能是浓度太低或离子化方式不合适，或选择的溶剂体系不合适 选择[M+H]+，还是+NH4，+Na等，要由化合物决定。加合离子若稳定，则可用，不稳定则可能需换流动相 MRM模式 MRM模式 395.2 25OHD2定性：413.4/355.5 25OHD2定量：413.4/395.2 [M+