4第四章目的基因的克隆及基因文库的构建.pptVIP

差示筛选 （ Differential Screening ） 2011-9-26 目的基因的克隆及基因文库的构建 67 （ 3 ）应用扣除杂交法构建 cDNA 文库 ? 原理： 用过量的参照细胞 mRNA 或 cDNA 与目的细胞 cDNA 或 mRNA( 又称目的序列 ) 杂交，形成的 RNA-cDNA 杂交体是两种细胞共有的， 将其扣除；剩下的 cDNA 或 mRNA 可以标记成探针 ( 称减法或扣除探 针 ) ，从上述目的细胞的 cDNA 文库中筛选目的克隆。 ? 不是细胞内所有表达基因的集合，而是差异表达基因的 cDNA 的集 合。 ? 实质：是除去了高丰度非特异性表达的大多数 cDNA ，含有的是特 异表达的 cDNA 克隆及一些低丰度表达的 cDNA 克隆。 2011-9-26 目的基因的克隆及基因文库的构建 64 （五）化学合成法克隆目的基因 ? 随着寡核苷酸化学合成的自动化，基因的化学合 成变得更经济、容易和准确。 ? 前提条件：对基因的结构序列清楚。 ? 合成策略：基因片段的全化学合成 基因的化学 - 酶促合成 目的基因的克隆及基因文库的构建 31 2011-9-26 1. 化学合成法的基本策略 （ 1 ）全基因合成 化学合成目的基因的前提条件是基因的 DNA 序列已知，有三种策略。 ①小片段粘接法 根据目的基因全序列，分别合成 12-15 个碱基的单链 DNA 小片段 混合退火 T4-DNA 连接酶连接 克隆入合适的载体 2011-9-26 目的基因的克隆及基因文库的构建 32 ②补丁延长法 根据目的基因两条互补链的全序列，分别合成 12-15 个碱基的单 链 DNA 小片段以及 20-30 个碱基的单链 DNA 中片段。 混合退火 Klenow 酶聚合 T4-DNA 连接酶连接 克隆入合适的载体 2011-9-26 目的基因的克隆及基因文库的构建 33 ③大片段酶促法 根据目的基因的全序列，分别合成 40-50 个碱基的单链 DNA 片段。 混合退火 Klenow 酶聚合 T4-DNA 连接酶连接 克隆入合适的载体 目的基因的克隆及基因文库的构建 34 2011-9-26 上述三种方法各有利弊 ? 化学合成 DNA 的单片段愈短，收率就愈高，但由于化学合成的份 额较大，成本较高。 ? 在大片段酶促法合成目的基因时，虽然化学合成的份额相对较小 ，成本较低，但大片段化学合成的收率极低。例如，每聚合一个 单体的产物收率为 95% ，则合成 50 个碱基的 DNA 单链大片段的总收 率只有 7.7% 。 2011-9-26 目的基因的克隆及基因文库的构建 35 （ 2 ）探针等寡聚核苷酸合成 ? 在某些情况下，往往只知道目的基因编码产物的部分氨基酸序 列，而基因序列未知。此时 需要从已知的氨基酸序列推测其 DNA 序列，然后合成探针， 筛选由鸟枪法或 cDNA 法得到的基因文库 ，最终获得含有目的基因的重组子。 ? 由于大多数氨基酸拥有简并密码子，故在探针序列的设计时必 须考虑下列问题： 生物体对简并密码子的偏爱性，合成系列探针。 探针应具有足够的长度，通常在 17-20 个核苷酸之间。 探针内部不应出现可能的互补区域。 2011-9-26 目的基因的克隆及基因文库的构建 36 某段连续的氨基酸序列 所有可能的 DNA 序列 Cys Met Asp Glu Met Lys Arg Asn Ile 设计的简并探针序列 TGT ATG GAC GAA ATG AAA AGA AAC ATA C T G G G T T C TG T ATGGA C GA I ATGAA TG T ATGGA T GA I ATGAA 三个位点，八条引物 TG C ATGGA C GA I ATGAA TG C ATGGA T GA I ATGAA A G 此外还可以参考各种生物体的 EST 数据库进行倾向性简并序列设计。 2011-