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研究蛋白质与 DNA 相互作用的主要方法 一、引言 在许多的细胞生命活动中，例如 DNA 复制、mRNA 转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到 DNA 与蛋 白质之间的相互作用的问题。 重组 DNA 技术的发展，人们已分离到了许多重要的基因。现在的关键问题是需要揭示环境因子及发育 信号究竟是如何控制基因的转录活性。为此需要： a、鉴定分析参与基因表达调控的 DNA 元件； b、分离并鉴定这些顺式元件特异性结合的蛋白质因子； 这些问题的研究都涉及到 DNA 与蛋白质之间的相互作用。 研究 DNA-蛋白质相互作用的实验方法主要包括： a、凝胶阻滞实验； b、DNase 1 足迹实验； c、甲基化干扰实验； d、体内足迹实验； f 、拉下实验。 二、凝胶阻滞实验 1、概念： 凝胶阻滞实验（Gel retardation assay ），要叫做 DNA 迁移率变动试验（DNA mobility shift assay ）或条带 阻滞实验（Band retardation assay ）是在八十年代初期出现的用于在体外研究 DNA 与蛋白质相互作用的一 种特殊的凝胶电泳技术。 2、原理： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的 DNA 分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反 比。如果某种 DNA 分子结合上一种特殊的蛋白质，那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到 阻滞，于是朝正极移动的距离也就相应的缩短，因而在凝胶中出现滞后的条带，这就是凝胶阻滞实验的基 本原理。 3、过程: 首先制备细胞蛋白质提取物（理论上其中含有某种特殊的转录因子） 用放射性同位素标记待检测的 DNA 片段（含有转录因子的结合位点） 这种被标记的探针 DNA 同细胞蛋白质提取物一起进行温育，于是产生 DNA-蛋白质复合物 在控制使 DNA-蛋白质保持结合状态的条件下，进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 最后进行放射自显影，分析电泳结果 4 、实验结果的分析： a、如果有放射性标记的条带都集中于凝胶的底部，这就表明在细胞提取物中不存在可以同探针 DNA 相互 1 结合的转录因子蛋白质； b、如果在凝胶的顶部出现放射性标记的条带，这就表明细胞提取物存在可与探针 DNA 结合的转录因子蛋 白质。 5、DNA 竞争实验： DNA 竞争实验（DNA competitive assay ）的具体做法如下： 在 DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争 DNA （competitor DNA），如果它同探针 DNA 结合的是同一种转录因子蛋白质，那么由于竞争 DNA 与探针 DNA 相比是极大超量的，这样绝大部分 转录因子蛋白质都会被竞争结合掉，而使探针 DNA 仍然处于自由的非结合状态，可以在电泳凝胶的放射自 显影图片上就不会出现阻滞的条带； 如果反应体系中加入的竞争 DNA 并不能同探针 DNA 竞争结合同一种转录因子，结果在电泳凝胶中的放 射自显影图片上就会出现阻滞的条带。 6、应用： a、凝胶阻滞实验可以用于鉴定在特殊类型细胞蛋白质提取物中，是否存在能同某一特定的 DNA （含有 转录因子结合位点）结合的转录因子蛋白质； b、DNA 竞争实验可以用来检测转录因子蛋白质同 DNA 结合的精确序列部位； c、通过竞争 DNA 中转录因子结合位点的碱基突变可以研究此种突变竞争性能及其转录因子结合作用的 影响； d、也可以利用 DNA 同特定转录因子的结合作用通过亲和层析来分离特定的转录因子。 三、足迹实验 1、定义: 足迹实验（foot-printing assay ），是一种用来检测被特定转录因子蛋白质特异性结合的 DNA 序列的位置 及其核苷酸序列结构的专门实验方法。 2、原理： 当 DNA 分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受 DNaseI 酶的切割作用， 而不会产生出相应的切割分子，结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区，俗称为 “足迹” 。 3 过程： 32 将待检测的双链 DNA 分