水产微生物 水产生物病原菌的分离和鉴定技术 水产生物病原菌的分离与鉴定.docVIP

水产生物病原菌的分离与鉴定 经过长期的养殖生产实践，人们可以根据患病水产养殖动物不同的外部特征来初步诊断患病情况及判定病原菌，这种诊断技术较为快速、简便，不过其主要是根据长期经验积累的结果，可靠性较低，容易发生误诊。要准确确定病原菌种类和对症治疗，必须采用细菌学的检测方法。水产生物致病菌的检测操作主要有直接涂片镜检、致病菌分离培养、生理生化试验、血清学试验、分离菌株的人工回归感染试验、药物敏感试验，以及分子生物学鉴定技术等过程，即利用细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及核酸测定等方法检测鉴定分离细菌的属、种、型。我国于2006年发布了水产行业标准《SC/T 7201.1-2006鱼类细菌病检疫技术规程》，其中分别对柱状嗜纤维菌烂鳃病、嗜水气单胞菌及豚鼠气单胞菌肠炎病、荧光假单胞菌赤皮病、白皮假单胞菌白皮病的诊断方法制定了操作规范。 一、细菌的分离培养和纯化 要研究和检测、鉴定患病水产生物的某种病原菌，首先获得该菌的纯种培养物，从患病动物的脏器或藻类表面以无菌法取样、划线接种到合适的平板培养基，让其长出单个菌落，取菌落再分离培养，确认为一种细菌后进行纯化，将纯化菌种保存，用于鉴定。如果要鉴定水中的某种细菌，则按上述方法从水体分离获取该细菌的纯培养物。 1. 培养基配制 在进行分离培养之前首先制备培养基，一般所用的细菌培养基是营养肉汤培养基和营养琼脂培养基。制备营养肉汤培养基时需用牛肉膏、蛋白胨、磷酸氢二钾、食盐和水。制好后置于高压灭菌器中灭菌备用。而营养琼脂培养基是在营养肉汤中加入一定量琼脂，制好后先在高压蒸汽器以120℃灭菌20 min，再置于37℃恒温箱内 2. 病原菌的分离培养 分离最常用的方法有稀释平板法、平板划线法及选择性培养基分离法等。 按照SC/T 7103—2008 《水生动物产地检疫采样技术规范》（见附录），采集具有典型发病症状或濒死鱼（虾蟹等），按常规无菌操作法取血液、肌肉、鳃、肝、肾、脑、性腺等组织，划线接种于普通营养琼脂培养基（或TCBS或其他适宜的分离培养基）上，28℃恒温培养 24h（根据菌种选择适宜的培养温度和培养时间），对初次分离得的细菌进行分离纯化培养得到纯培养的菌株，并转接到斜面培养后于4℃冰箱中或低温冰箱保存备用。在分离、检测过程中还要注意:做平行样，以保证结果的可靠性;设立空白对照， 不同微生物需要不同的营养物质和环境条件，而且对不同的化学试剂，如消毒剂（酚）、染料（结晶紫）、抗生素及其它物质等具有不同的抵抗力。利用此特性可配制适合于某种微生物生长而限制其他微生物生长的各种选择性培养基，以达到分离纯种的目的。也可以将待分离的样品先进行适当处理，以消除不希望分离到的微生物。因此，可以将从正常菌群存在部位采取的标本应接种于选择性或鉴别性培养基上。 对一些生理类型比较特殊的微生物，为了提高分离几率，往往在涂布分离前先进行富集培养，提供一个特别设计的培养环境帮助其生长，而不利于其它微生物的生长。需氧菌一般采用平板分离培养，厌氧菌一般采用焦性没食子酸法或厌氧箱（罐）或二氧化碳培养法。 划线分离接种后放28℃或37℃培养，一般经16～20h大多可形成菌落。但有些细菌生长缓慢，如诺卡氏菌需经3～4周或 二、细菌染色、形态观察 细菌形态观察是细菌检验的重要方法之一，是细菌分类和鉴定的基础，可根据其形态、结构和染色反应等为进一步鉴定提供参考依据。 1. 细菌染色技术 由于微生物个体微小，菌体较透明或半透明，不染色往往不易观察和识别。除了观察活体微生物细胞的运动性和直接计算菌数外，都需要借助染色法使微生物菌体着色，使之与视野背景形成鲜明的对照而易于在显微镜下观察。因此，涂片与染色是微生物的基本操作技术。 微生物染色是借助物理因素和化学因素的作用而进行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作用等。化学因素则是细胞物质和染料发生的各种化学反应。染色液的酸碱性会影响染色效果，常用的染色剂多为碱性染料，如美蓝、碱性复红、结晶紫等，使菌体显示出颜色，便于观察与鉴别。酸性染色剂不能使细菌着色，而能使背景着色形成反差，故称为负染。此外，菌体细胞的构造和外膜的通透性（如细胞膜的通透性、膜孔的大小）和细胞结构、菌龄、培养基组成、染色液的pH、温度、药物的作用等都能影响菌体的染色。微生物染色常用染料如表3-7所示。 表3-7 微生物染色常用染料 染色剂 性质 用途 刚果红 酸性 细菌负染色、酵母菌染色 伊红 酸性 细胞质染色、染细胞的嗜酸性颗粒 酸性复红 酸性 单染色等 碱性复红 碱性 核染色、鉴别结核杆菌 番红（沙黄） 碱性 革兰氏染色、核染色 美兰 碱性 活体染色、放线菌染色、氧化还原指示剂 孔雀绿 碱性 细菌芽胞染色 亮绿 碱性 细菌、螺旋体的染色，鉴别培养 中性红 碱性 活体染色