通用性配体亲与层析法.pptVIP

第七章亲和层析 般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的 主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性 XNY缺点 由于这种差异性较小,因此要得到一种纯度稍高的物 质,常常需要繁琐的操作,经历较长的时间,但最终 收得率却甚低 ◆1967年Axen等 用溴化氰活化多糖凝胶偶联肽和蛋白质的方法,并成 功地制备了固定化酶。 Y这种利用大分子物质具有的特异的生物学性质进行纯 化的方法,于20世纪70年代就有了惊人的发展,并逐 步得到了广泛的应用。 这使酶类等大分子物质的纯化过程变得较简单、迅速 和高效(见表7-1) 表7-1亲和层析纯化人血清中a-抗胰蛋白酶 步骤 总活性 比活性 回收率% 纯化倍数 硫酸铵分级° DEAE-Sephadex 01 ConA-Sepharose 16,6 抑制蛋白酶的四数;抑制蛋白酶的冯数/A-吸收值;含有0.5g蛋白质相当于10ml血清;和收集 最高峰的活性部分。 第一节基本原理 ◆M-L-S复合物 欲分离的大分子物质S 与相对应的专一物质L(配体)以次级键结合(亲和 能生成一种可解离的络合物LS, 其中的L又能与活化的基质M以共价键首先结合, Y而形成ML复合物。 人·亲和吸附剂 配体L以共价的方式固化到含有活化基团的基质M 上,制成亲和吸附剂ML,或者叫做固相载体 亲和层析法 根据LS之间能可逆地结合与解离的原理发展起来的 层析方法,称为亲和层析法 affinity chromatography)o 亲和层析的原理(见图7-1) 每对反应物之 间都有一定的 亲和力 正如在酶与底物 的反应中,特 异的底物S)才 能和一定的酶 (E)结合,产生 3 复合物(ES) 样 在亲和层析中 是特异的配体 j+8 才能和一定的 生命大分子之 间具有亲和力, 图71亲和层析的原理示意图 并产生复合物 1.酶与底物反应产生酶底复合物;2.活性基质与配体结合产生亲和吸附剂 3.亲和吸附剂与样品中有效成分(S)结合产生偶联复合物和未结合的物质(杂质) 4.偶联复合物经解离后,得到纯有效成分(S) 层析分离过程: 样品过柱时, 样品中对配体有亲和力的物质S就可借助静电引力、 范德瓦尔力,以及结构互补效应等作用吸附到固相载 体上 无亲和力或非特异吸附的物质则被起始缓冲液洗涤出 来,并形成了第一个层析峰; 然后,恰当地改变起始缓冲液的 pH值、 或增加离子强度、 或加入抑制剂等因子, 即可把物质S从固相载体上解离下来,并形成了第二 个层析峰(见图7-2B)。 0. Imol/L酸盐pH10 t 2 9x=A= 6FB 0.1molL姗酸盐p10 图7-2E,coli提取液在 Sepharose4B(A)和对氨基苯-P-D-硫 代吡喃半乳糖苷- Sepharose.柱(B)的层析l 对氨基苯-p-D-硫代吡喃半乳糖苷是阝半乳糖苷酶底物的类似物。柱平衡液为0.05ml/LTes-lCI 缓冲液,pH.5;洗脱液为0.1mol/L硼酸钠盐溶液,pH105;抽提液20ml加在1.5cm×22cm柱上, 23℃,流速80m/h,每管收集0.8ml;B图中左和右柱状图分别为A图中第40管和B图中第95管收 集液的PAC图谱 如果样品液中存在两个以上的物质与固相载体具有亲 和力(其大小有差异)时, 刂采用选择性缓冲液进行洗脱,也可以将它们分离开。 使用过的固相载体经再生处理后,可以重复使用。 ◆上面介绍的亲和层析法亦称 特异性配体亲和层析法 配体,一般为 复杂的生命大分子物质(如抗体、受体和酶的类似 底物等),它具有较强的吸附选择性和较大的结合力; ◆另有一种亲和层析法叫: 通用性配体亲和层析法 配体,则一般为 简单的小分子物质(如金属、染料、以及氨基酸等), 它成本低廉,具有较高的吸附容量,通过改善吸附和 脱附条件可提高层析的分辨率。