门冬酰胺酶的制备与分析.pdfVIP

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定 赵雅嫱 黄妤璠 龙益如 王敏敏 白华山 1 原理 本实验主要是利用基因工程手段构建 L-天冬酰胺酶基因工程菌。 L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非 霍奇金淋巴瘤和 ALL 的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素 瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢 性淋巴细胞性白血病等。 目前，我国虽已投入生产 L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、 菌种产酶活性低，提取 化工艺落后。针对这些 问题，本实验对大肠 杆菌重组 L-天冬酰胺酶的制备、 化与鉴定进行了系统性的探究，意 图改进重组 L-天冬酰胺酶的表达，优化其 化工艺，分析其鉴定方法 与性质。 本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的 摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离 化手段的比较和选择， 如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex 和 DEAE-Sepharose 离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测 定等等。 2 实验材料 实验仪器见表 1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。 表 1.1 实验仪器或装置 仪器名称 型号 生产厂家 超净工作台 PCR 扩增仪 恒温培养箱 超低温冰箱 台式离心机 恒温摇床 涡轮振荡器 高压灭菌锅 蛋白电泳仪 核酸 电泳仪 凝胶成像仪 紫外分光光度 计 高效液相色谱 仪 扫描型紫外分 光光度计 制冰机 超声清洗机 　 　 实验试剂和材料见表 1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以 及实验室现有条件核定。 表 1.2 试剂和材料 材质或 试剂或材料 来源 规格 CPU21 E.coli 野生型菌株 实验室储存 009 pMD18-T 50ng/μl 宝生物工程有限公司 pET-22b 50ng/μl 宝生物工程有限公司 Nde Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司 Xho Ⅰ 10U/μl 宝生物工程有限公司 350U/μ T4 DNA Ligase 宝生物工程有限公司 l 离心柱 天根生化科技（北京）有限公 DNA 化试剂盒 型 司 Ni-NTA 树脂 化 离心柱