pcr技术(包含引物设计).pdfVIP

聚合酶链式反应（PCR） 原理： DNA 的半保留复制时，双链 DNA 在多种酶的作用下可以变性解 链成单链，在 DNA 聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配 对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA 在高温 时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。 因此，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，并设计引物做启 动子，加入 DNA 聚合酶、dNTP 就可以完成特定基因的体外复 制。PCR 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序 列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR 由变性 - 退火(复性）- 延伸三个基本反应步骤构成： ①模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 94℃左右一定时间 后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使 之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备； ②模板 DNA 与引物的退火(复性) ：模板DNA 经加热变性成单链 后，温度降至 40~60℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列 配对结合； ③引物的延伸：DNA 模板 - 引物结合物在DNA 聚合酶的作用 下，于 72℃左右，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱 基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的 半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”， 而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。 PCR 技术分类（常用） （1）反向 PCR 技术(Inverse PCR, IPCR) ：反向PCR 是克隆已 知序列旁侧序列的一种方法．主要原理是用一种在已知序列中 无切点的限制性内切酶消化基因组 DNA．后酶切片段自身环 化．以环化的 DNA 作为模板，用一对与已知序列两端特异性结 合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的 DNA 片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼 DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化， 可以得到大小不同的模板 DNA，再通过反向 PCR 获得未知片 段 。 （2）锚定 PCR 技术(Anchored PCR, APCR) ：用酶法在一通用 引物反转录cDNA3 ’-末端加上一段已知序列, 然后以此序列为 引物结合位点对该cDNA 进行扩增, 称为 APCR 。 （3）不对称 PCR 技术(asymmetric PCR) ：两种引物浓度比例 相差较大的 PCR 技术称不对称 PCR。在扩增循环中引入不同的 引物浓度, 常用 50～100÷1 比例。在最初的 10～15 个循环中 主要产物还是双链 DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引 物介导的 PCR 反应就会产生大量单链 DNA。 （4）反转录 PCR 技术(reverse transcription PCR, RT-PCR) ：当 扩增模板为 RNA 时, 需先通过反转录酶将其反转录为 cDNA 才 能进行扩增。应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等 都经常采用。 （5）巢式 PCR 技术(NEST-PCR) ：先用一对靶序列的外引物扩 增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的 PCR 带, 此为巢式 PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式 PCR。为减少巢式 PCR 的操作步骤可将外引物设计得比内引物 长些, 且用量较少, 同时在第一次 PCR 时采用较高的退火温度而 第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次 PCR 时, 由于较高退 火温度下内引物不能与模板结合, 故只有外引物扩增产物, 经过 若干次循环, 待外引物基本消耗尽, 无需取出第一次 PCR 产物, 只需降低退火即可直接进行 PCR 扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种 PCR 称中途进退式 PCR， 主要用于极少量 DNA 模板的扩增。 （6）多重 PCR 技术(multiplex PCR) ：在同一反应中用多组引物 同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电 泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时 检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。 （7）重组 PCR 技术：重组 PCR 技术是在两个 PCR 扩增体系中, 两对引物分别由其中之一在其 5’-端和 3’-端引物上带上一段 互补的序列,混合两种 PCR 扩增产物,经变性和复性,两组 PCR 产 物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在 PCR 条件下发生 聚合延伸反应,产生一个包含两个