免疫组化(DAB试剂盒标准).docxVIP

脱 脱蜡，透明，入水 抗原修复 制作石蜡切片 显色 孵育 免疫组织化学技术 ， 流程图： ，详细操作： 制作石蜡切片（详见后面的材料） 脱蜡，透明，水化 脱蜡前先 60 度烘片 30-40min; 二甲苯脱蜡透明：将切片置于二甲苯中（3 缸），各 15min。 注意：若标本放入二甲苯后出现水雾或标本不呈现透明色，说明脱 水没有脱干净，可重新放置二甲苯中；液体一定要没过标本 3）梯度乙醇入水：将切片依次置入 100%乙醇，95%乙醇，90%乙 醇，80%乙醇，70%乙醇中，纯水（自己接），各 5min; （3）抗原修复 操作：1）6min45s 烧开修复液 (柠檬酸 0.2g+柠檬酸三钠 1.5g 蒸馏水稀释至 500mL,PH 为 6.0) 将组织放入修复液置于微波炉中焖 5 分钟 将修复液 1min20s 再烧开 组织再焖 5 分钟 取出烧杯，使液体和组织自然冷却 PBS 冲洗 3 分钟 1 次,0.1%triton 10min(破坏细胞膜)， PBS 冲洗 3 分钟 1 次 （4）孵育 操作：1）阻断内源性过氧化物酶：将切片置于 3%过氧化氢 10min，  PBS 冲洗 3 分钟 x3 次； 封闭（非特异性染色阻断剂）：每个脑片 35ul 山羊血清， 室温下孵育 30 分钟（注意：此步操作后不用 PBS 冲洗）； 加一抗(PCNA 兔抗大鼠)：滴加适当比例稀释的一抗工作 液（1:200 比较好）2h，PBS 冲洗 3 分钟 ? 3 次； 加完一抗后，最好 4 度冰箱过夜，注意标本要保持湿度，可 放在湿盒，第二天在 37 度或者室温复温 30—40min，复温也要放在 湿盒内 加二抗（生物素标记的羊抗兔 IgG 复合物）：室温孵育 10 分钟，PBS 冲洗 3 分钟 ? 3 次； 加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶：室温孵育 10 分钟， PBS 冲洗 3 分钟 ? 3 次； （5）显色 1）DAB 染色：每个脑片 35ul 新鲜配制的 DAB 显色液， 室温孵 育 10-20s（颜色有变就好，条件要自己摸）→大量自来水冲洗。 2）苏木素复染：苏木素染色 30s（可以用塑料架子浸泡或者枪 头滴）→自来水冲洗→PBS 溶液返蓝 10-20min（还可以浸泡 10min 的纯水） 3）脱水，透明，封片：梯度乙醇脱水→二甲苯透明 2-3 分钟 →中性树胶封片（现用电吹风吹干片，直接用中性树脂封片，晾干， 观察片有脏时，可以用二甲苯擦洗背面） 备注： 1、PBS 配制：团队常用一包 PBS 粉末，配制 2000ml 纯水，加 6ml 的 NAOH，PH 在 7.2-7.4，（不同的粉末，配制不一样，加入的 NAOH 或者酸量不同，但是 PH 一般是一样的） 一抗工作液，一般配制成 5ml，0.3%的牛血清（0.15g），5% 的羊血清（250ul），余加纯水 一抗的浓度，不同的实验，浓度，物质都是不一样的 DAB：缓冲液：底物：色源=20:1:1，每次配制都要有预留的 部分，防止误差 用枪：不要触及液体的地步，一档吸二档打完