第06讲 克隆基因的检测与鉴定.pptVIP

第一讲 基因工程概论 第二讲 基因工程的主要技术 第三讲 基因工程的酶学基础 第四讲 基因克隆的载体与受体 第五讲 目的基因的分离与克隆 第六讲 克隆基因的检测与鉴定 第七讲 基因表达调节与产物纯化 第八讲 从原核到真核基因工程 三、杂交抑制转译法 mRNA一旦与DNA杂交成RNA-DNA双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。 单链mRNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 能翻译 mRNA DNA 核糖体 小亚基 核糖体 大亚基 不能翻译 1. 原理 2. 过程 四、杂交释放转译法 1. 原理： 在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的mRNA，进行体外转录。 研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）。 2. 过程 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 总mRNA cDNA基因的 mRNA 杂交 洗脱 cDNA基因的 mRNA 体外翻译 cDNA编码的蛋白 电泳 凝胶放射自显影 cDNA编 码的蛋白 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 硝酸纤 维素滤膜 载体和插 入的cDNA 收集 35S标记的氨基酸 专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白质因子。 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 待测蛋白质 硝 酸 纤 维 素 滤 膜 能与蛋白质结 合的DNA序列 放射性标记 五、DNA-蛋白质相互作用筛选法 一般克隆与筛选策略 第七节 几种常用的真核生物重组基因选择方法 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶（dihydrofolate reductase，DHFR） 一、哺乳动物基因转移的选择标记 1. 胸苷激酶（thymidine kinase, tk） （1）TK选择原理 ①四氢叶酸的必要性 DHFR ②氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作用 氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物。 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、dCTP和dTTP的合成： dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉 抑制 抑制 ④胸苷酸激酶的补救作用 TK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（T）合成TTP，存活。 T tk ③次黄嘌呤的补救作用 细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和dCTP。 dUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤 补救 氨甲喋啉 抑制 抑制 ① HAT培养基： Tk- 细胞株。 TK基因。 ② 宿主细胞 ③ 载体标记 （2）TK选择过程 含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基。(hypoxanthine，aminopterin，thiymidine） 只有转入TK基因的细胞才能生存。 真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。 2. 二氢叶酸还原酶基因（DHFR） （1） 选择原理 ①二氢叶酸还原酶的必要性 dUMP dATP TTP dCTP 四氢叶酸 四氢叶酸 DHFR+细胞 二氢叶酸 四氢叶酸 二氢叶酸还原酶 二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸 DHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸。 能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存 不需要补救！ DHFR- 细胞 DHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸。 不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存。 需要补救！ ② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救 dUMP dATP TTP dATP 次黄嘌呤 补救 胸苷 补救 无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻时， 胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救: DHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。 ① 宿主细胞 （2）选择过程 透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救。 ② 无核苷酸的培养基 需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！ ③ 氨甲喋呤“加压” 添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的补救作用，可提高选择。 DHFR+基因。 ④ 载体标记 只有转入DHFR+基因的细胞才能生存。 DHFR- DHFR- DHFR+ DHFR+ live die 无核苷酸的培养基 是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物。 3. 新霉素抗性基因（neor） （1）选择原理 ① 新霉素（neomycin） 新霉素的类似物，是一种氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性。 ② G418（geneticin） ③ 新霉素抗性基因--neor 细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一种磷酸转移酶（APH），能使G418失活。 G418 真核细胞 死亡 G418 存活 neor 真核细胞 含致死剂量G418的完全培养基。 ① G4