第五章凝胶层析.ppt

凝胶层析 gel-filtration chromatography 凝胶层析的基本原理 凝胶层析是利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，对混合物中各组份按分子大小进行分离的层析技术，又称为分子筛，凝胶/分子筛排阻层析。 凝胶层析可用于重组蛋白溶液脱盐、分子量测定以及除去热原物质分离纯化。 操作简便，分离效果好，重复性高，回收率高，分离条件温和。 分子直径比凝胶最大孔隙直径大的，会被全部排阻在凝胶颗粒之外，即全排阻；两种全排阻的分子即使大小不同，也不能分开；它们下行速度都快。 分子直径比凝胶最小孔隙直径小的，能进入凝胶颗粒的全部孔隙即使大小不同也不能分开；它们的下行速度都慢。 2 凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶 Sephadex G-系列 聚丙烯酰胺凝胶 Sephacryl系列 琼脂糖凝胶 Sepharose系列 Superose系列 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升。 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解。 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温。 Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶质的凝胶过滤 。 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose（ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）。 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大分子物质（如蛋白质和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种（ 数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度）。 凝胶介质的选用原则 组别分离 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G-15、Bio-Gel P-2或P-4。 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离。 该策略也是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶。在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 凝胶层析应用举例 凝胶层析纯化辣木絮凝剂 凝胶层析纯化细胞色素C* 例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。 2．分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入； 第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。 不同分离范围的葡聚糖凝胶上，血清蛋白的层析图 如用Sephadex G-200分离血清蛋白质的效果要比Sephadex G-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见右图）。 凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达