《HPLC实验步骤和方法开发》.pptVIP

4.离子对色谱法 在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂 与样品中可电离的组份形成“对离子” 在反相色谱柱上分离离子型化合物 离子对试剂的类型 季铵盐、叔胺盐 （正离子），适用于弱酸 烷基磺酸盐、高氯酸盐（负离子），适用于弱碱 烷基长度不同，形成对离子的能力不同 离子对色谱机理 离子对色谱的应用 抗组胺及减充血剂药物的分析 离子对色谱分析水溶性维生素 用离子对、还是用离子抑制方法？ 方法开发的其他因素 流速对柱效的影响 不同内径的色谱柱有自己的最佳流速 样品的进样量(浓度)对柱效的影响 样品的进样体积对柱效的影响 溶剂粘度对柱效的影响 以上因素均影响分离度 色谱方法转换 如果没有与文献或要求相近的色谱柱 转换进样量 转换流速 四）液相色谱方法开发 梯度洗脱方法 在这一部分您将学习: 关于梯度洗脱过程及其优点. 如何优化梯度分离. 有关梯度分离的一些实用考虑. 液相色谱泵 稳定平滑并且重现性好的流速 可靠且充分的溶剂混合 准确及重现的自动溶剂混合 准确及重现的梯度形成 有效的流速范围 制备色谱或微柱、窄柱色谱要考虑 滞后体积 梯度分析更为关注 目的：在任何情况下保持最高精度 梯度的洗脱方式 高压梯度及低压梯度 梯度滞后：系统体积的影响 死体积/谱带展宽体积(无色谱柱时) 滞后(系统)体积 滞后(系统)体积 溶剂输送系统(泵) 检测器 进样器 色谱柱 梯度混合器 溶剂输送系统(泵) 高压梯度 注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 比例阀 检测器 进样器 A B C D 色谱柱 溶剂输送系统(泵) 低压梯度 阻尼器 混合器 梯度滞后大小的影响 滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受 滞后体积的不同会使方法转换麻烦 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好 普通分析型液相色谱的滞后体积为1~4ml（戴安的4元泵700μl，高压泵400μl ） 滞后体积变化的影响 设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果： 梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性 梯度百分比 保留时间 梯度曲线 好的梯度 滞后曲线 保留时间 梯度百分比 不好的梯度 滞后曲线 固定滞后体积，改善了梯度性能 普通的低压梯度系统 色谱柱反压变化对梯度实验的影响 P680A LPG without pulse damper Back-pressure:60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 1% 5 6 8 10 12 -100 200 400 600 900 mAU Minutes Methylparabene Ethylparabene Propylparabene Butylparabene 5 6 8 10 12 -100 200 400 600 900 mAU Minutes Methylparabene Ethylparabene Propylparabene Butylparabene Pump with pulse damper Back-pressure:60 bar, 85 bar and 105 bar Variation: 2% Acclaim 120, C18, 5 μm, 4.6 x 100 mm; 0.5 mL/min; 25°C; 5 μL injection volume; UV detection at 256 nm; Eluent (A) Water and (B) Acetonitril; Gradient: 30 % b to 100 % B in 10 min; Methyl-, Ethyl-, Propyl- and Butylparabene, 10 mg/L each 梯度洗脱的特点 优点 缩短分析时间 增加分离能力 检测灵敏度提高 缺点 仪器设备要求高 不适合某些检测方式(RI) 柱需再生平衡 定量分析的重复性较低？ 一般流出问题 早流出峰的分离度差. 迟流出峰的峰宽增加而峰高降低. 由于k’范围宽，所以分析时间长. 强保留组分造成柱污染. 等梯度洗脱 - 在洗脱样品的整个过程中，流动相的组成保持不变. Analytical Education Center H5929A 11-09 梯度洗脱 - 一个解决方案 优点 改善分离度