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第 七 章 核 酶 酶工程 湖北工业大学 第七章 核 酶 具有生物催化功能的核酸，称为核酶，其化学本质是核酸，但具有酶的特异性催化作用。 具有生物催化功能的DNA分子，称为脱氧核酶。 核酶及脱氧核酶的发现，推翻了酶的化学本质只是蛋白质的传统观念。 第一节 核 酶 第二节 脱 氧 核 酶 第三节 核酶的应用 第一节 核 酶 核酶最早由Cech和Altman分别于1981年和1983年研究四膜虫的rRNA和细菌的RNaseP时发现。 化学本质：RNA；作用：参与细胞内RNA及前体的加工和成熟过程；底物：多为RNA，也有一些是DNA、氨基酸酯；催化效率：比蛋白质酶低得多，且需要金属离子的辅助；催化反应类型：水解作用、连接作用、转核苷酸作用。 结构特点：I型内含子、II型内含子、RNaseP的RNA亚基、发夹状核酶、锤头状核酶、肝炎δ病毒核酶、VS核酶。 分子大小：大分子核酶和小分子核酶。大分子核酶包括I型内含子、II型内含子、RNaseP的RNA亚基。小分子核酶包括发夹状核酶、锤头状核酶、肝炎δ病毒核酶、VS核酶。 作用机制：剪接型核酶和剪切型核酶。 一、剪接型核酶 既可以剪切，又可以连接的核酶，即先通过剪切去掉自身RNA内一个核苷酸片段，再将剪切后剩下的两个片段连接起来，从而实现RNA前体的自我拼接。 （一）I 型内含子的自我剪接 广泛分布于细胞器基因和核基因中，噬菌体中也有。代表分子有：四膜虫大核26SrRNA前体、酵母线粒体中Cytb的mRNA前体、T4噬菌体胸腺嘧啶合成酶mRNA前体等。I型内含子在体外的催化反应需要Mg2+和鸟苷或5/-鸟苷酸参与。 I型内含子的剪切机制（过程）：L-19 IVS ① rRNA前体中的IVS发生折叠，形成一定的空间构象； ② 由一个鸟嘌呤核苷G的3/-OH作为亲核基团攻击5/端剪接位点的磷酸二酯键，使5/端脱落，鸟嘌呤核苷与内含子序列的5/端形成新的磷酸二酯键，5/端外显子的3/端生成羟基。该反应为一次转酯反应。 ③ 5/端外显子的3/-OH成为亲核基团，攻击3/端外显子与内含子之间的磷酸二酯键，形成新的磷酸二酯键，两个外显 子序列连接起来，同时释放出IVS。此为第二次转酯。 ④ 释放出的线性IVS又经过两次转酯反应分别释放出15个和4个核苷酸片段，形成一个稳定的线性IVS。 （二）II 型内含子的自我剪接 主要存在线粒体中，在真菌、原核生物、植物的rRNA、tRNA、mRNA中均有发现。 II型内含子与I型内含子的剪接机制相类似，也是通过两次转酯反应，但不需要鸟苷的辅助。 ① 内含子中一个保守的腺嘌呤残基的2/ -OH 亲核攻击5/端剪接位点的磷酸二酯键，并结合形成一个套环； ② 被切下的5/端外显子的3/ -OH对内含子3/端剪接位点进行亲核攻击，外显子连接起来，释放出套环状的内含子。 II型内含子自我剪接过程示意图 二、剪切型核酶 催化自身或异体分子切割的核酶，其作用相当于核酸内切酶。 （一）自我剪切型 包括植物类病毒RNA、植物病毒的卫星RNA及肝炎δ病毒核酶。 特点：只切（剪）不接，在Mg2+或其他二价金属离子存在下，在特点位点进行自我剪切，形成5/ -OH和2/ ,3/ -环磷酸二酯末端。 1. 锤头状核酶 包括类病毒和拟病毒两类。 催化机理： 单金属离子催化：由金属氢氧化物作为广义碱进攻2/ -OH，活化的2/ -OH作为亲核试剂进攻切割位点的磷酸基团。 双金属离子催化：A位点的金属离子接受2/氧的电子，使2/ -OH去质子更容易。B位点的金属离子接受5/氧的电子，使O-P键极化并使键合力减弱，从而使氧原子更容易游离出来。 第 七 章 核 酶 酶工程 湖北工业大学