免疫标记技术和分析应用讲义.ppt

3. 夹心法： + + + 双抗体夹心法 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法 获得待分析物的未标定抗体 将特异性抗体与固相 载体连接形成固相抗体 洗涤除去未结合的 抗体及杂质 加入封闭蛋白溶液以封闭载体 表面残留的蛋白结合位点 洗涤并除去未结合的封闭蛋白 加受检标本（抗原）形成 固相抗体－抗原复合物 洗涤除去其他 未结合的物质 加酶标抗体生成 抗体—待测抗原—酶标记抗体 的复合物 彻底洗涤 未结合的 酶标抗体 加底物进行 酶催化反应 根据颜色反应的 程度进行该抗原 的定性或定量测定 双抗体夹心法 双抗原夹心法原理 包被体 待测抗体 包被抗原 标记抗原 双夹心法 返回 4. 竞争法 竞争法的原理 固相支持物表面 待测物 包被抗体 标记抗原 此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体 。 用已知特异性 抗体包被 固相载体 测定管加待测抗原和 一定量的酶标抗原使二者与 固相抗体竞争结合 对照管只加一定量酶标抗原 与固相抗体直接结合 分别洗涤 除去未结合 的成分 加底物显色 分别测定两管的吸光度值， 根据对照管与测定管吸光度值之比， 计算标本中待测抗原含量 俘获抗体 （二抗） 待测抗体 标记抗原 包被体 5. 捕获法 血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法 包被体 待测抗原 包被连接物 标记抗体 俘获抗体 特点：所有试剂盒均采用同一包被物和包被工艺 （1）将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。 （2）加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。 （3）加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。 （4）加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。 （5）加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。 捕获法操作过程 食品中盐酸克伦特罗的测定 食品中毒素的测定（主要包括黄曲霉毒素， 赭曲霉毒素 ） 食品中有害微生物的快速筛检 （如沙门氏菌 ） 甲胺磷残留分析 甲基对硫磷残留分析 呋喃丹残留分析 ELISA在食品安全检测中的应用 ELISA用于农药残留的检测 河豚毒素 植物毒素如罌粟硷、吗啡、藻类毒素 苯并芘 主要有除草剂与杀虫剂两大类 例如杀暝松（ FN ）、 甲氟磷酸异已酶（ SOMAN ）、 草不绿（ Alachor ）、 西维因（ Carbaryl ）、 多菌灵及克菌丹（ Captan ）等。 农药的检测： ELISA检测 “非典型肺炎”冠状病毒 ELISA在结缔组织病早期诊断中的应用检测抗异质性胞核核糖蛋白A2（hnRNPA2）/类风湿性关节炎（PtA）33抗体 ELISA在疾病诊断中的作用 ELISA法检测幽门螺杆菌抗体 Enzyme Immunoassay（EIA） 第三节 就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 抗原抗体反应＋酶催化反应 肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计 特异、敏感 可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。 将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。 滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。 优点： ①灵敏度高，特异性强； ②可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查； ③试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污染； ④结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展； ⑤操作简便，易于掌握和使用，且重复性好； ⑥可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。 缺点： 标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。 一、常用的酶及其底物 酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。 常用酶 底物 显色辣根过氧化物酶 邻苯二胺、H2O2 橙黄色