荧光定量PCR引物设计实战.ppt

荧光定量PCR引物设计实战 目录 1. 荧光定量PCR引物的设计(SYBR) 2. 荧光定量PCR引物的鉴定 荧光定量PCR引物的设计(SYBR) 注意事项 PCR产物大小：80-300 bp均可，100-150 bp为佳. 最好跨外显子接头区设计引物，可避免DNA污染的影响. DNA mRNA 荧光定量PCR引物的设计(SYBR) 使用Oligo 7设计引物 在Oligo 7中输入mRNA全序列. 荧光定量PCR引物的设计(SYBR) 使用Oligo 7设计引物 调整PCR产物长度，设定为100-150 bp. 荧光定量PCR引物的设计(SYBR) 使用Oligo 7设计引物 点Search开始有哪些信誉好的足球投注网站引物. 荧光定量PCR引物的设计(SYBR) 使用Oligo 7设计引物 有哪些信誉好的足球投注网站结果 荧光定量PCR引物的鉴定 流程 提取RNA，逆转录成cDNA后，将其稀释2-3倍 稀释引物后，进行梯度退火的常规PCR，摸索可用的退火温度及最佳退火温度 根据上一步得到的信息进行荧光定量PCR，使用绝对定量模式对引物进行鉴定 记下退火温度，用于后续实验 改变退火温度继续进行实验，或更换其它引物 荧光定量PCR引物的鉴定 使用试剂盒：DreamTaq? Green PCR Master Mix (2X) 常规PCR摸索条件 反应体系：10 μL体系/管 DreamTaq Green PCR Master Mix (2×) 5.0 μL Primer-F（10 μmol/L） 0.2 μL Primer-R（10 μmol/L） 0.2 μL 模板 0.5 μL Dnase-free ddH2O 4.1 μL Total 10.0 μL 荧光定量PCR引物的鉴定 常规PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，然后对胶进行拍照，用于后续分析. 常规PCR摸索条件 1-50 ℃ 2-52 ℃ 3-54 ℃ 4-56 ℃ 5-58 ℃ 6-60 ℃ 荧光定量PCR引物的鉴定 用Image J软件对胶上的条带进行光密度分析，找出光密度最高的条带，其对应的退火温度即可初步定为最佳退火温度. 常规PCR摸索条件 荧光定量PCR引物的鉴定 将模板梯度稀释50、51、52、53、54倍，然后按照荧光定量PCR试剂盒的说明书加样（每个模板梯度至少3个复孔），上机进行反应，获取扩增曲线和熔解曲线以及标准曲线. 绝对定量法鉴定引物反应条件 扩增曲线 熔解曲线 荧光定量PCR引物的鉴定 标准曲线图： 绝对定量法鉴定引物反应条件 通过标准曲线的斜率（Slope）可以求得该次荧光定量PCR反应的理论扩增效率，公式为E=10|-1/slope|。理论扩增效率值在0.8-1.2之间都能接受. * *