电镜技术-第5次课.ppt

　 3）甲醛 甲醛为无色气体，溶于水，37％~40%的水溶液为福尔马林，甲醛曾作为早期电镜工作的固定剂，但当它浓度过高时，或脱水时会使细胞中某些物质因解固定而流失出现空洞现象，对细胞超微结构保存不好。甲醛在溶液形式下会形成长度不均的聚合物，会影响交联效力和渗透速度，曾被淘汰。 甲醛有以下优点： 渗透速度比戊二醛还要快，固定迅速，组织块大小 不受限制； 对酶活性的保存比戊二醛好； 经济方便。现在还是采用，但一般不单独使用，通 常作为四氧化锇和戊二醛的前固定剂，或和戊二醛 组成混合固定液。 　　高锰酸钾是具有绿色光泽的赤紫色结晶，在水中溶解度为6%，呈赤紫色溶液，它也是一种强氧化剂。 高锰酸钾的特点： 是磷脂蛋白的优良固定剂，空间关系保存好。 对神经髓鞘、脂质固定特别好，是细胞膜结构的良好固定剂。 对叶绿体的结构固定也好。 对生物样品有电子染色作用。 高锰酸钾对细胞的其它成分固定不好。对细胞内颗粒性或纤维 状结构固定效果欠佳，有些组织结构将会在固定期间和脱水过 程中发生变化，如线粒体和质体膨胀，核糖体、脂滴和微管丢 失，细胞核核孔增大等。 实验中通常采用3%高锰酸钾在4℃固定2h，用缓冲液冲洗几次后过夜，然后按标准步骤脱水。另外，用高锰酸钾固定的组织，一般不需用锇酸后固定。高锰酸钾也可以 作为戊二醛的后固定剂。 4）高锰酸钾 5）丙烯醛 丙烯醛(C3H4O)为单醛。 与大多数固定液相比，其渗透和反应速度均较快。 稍大一些的组织块可用丙烯醛作固定液。 丙烯醛与戊二醛混合液可较好保存微管。 当丙烯醛暴露在光和空气或某些化学药品中时，会 发生聚合并产生热量，商品丙烯醛含氧化抑制剂。 丙烯醛易燃，是危险化学品，可由呼吸系统吸人， 或通过皮肤吸收，并对皮肤有强烈刺激作用。 5、常用的固定操作法 动物组织 浸人固定 灌注固定 组织暂时储存 体外培养细胞 单层细胞 悬浮培养细胞 藻类细胞 淡水藻细胞 海藻细胞 植物材料 骨组织 动物组织取材通常采用灌注固定和浸入固定两种方式。 灌注固定可使组织得到快速、均匀而充分的固定，细胞成分稳 定，结构形态变化最小。 浸人固定则存在某些不足。如解剖时，动物血压的快速变化可 导致组织体积改变;动物缺氧和死后变化可引起组织形态改变; 组织外表面的固定可阻碍固定液进一步渗人;由于戊二醛和饿 酸渗透能力有限，往往便尺寸偏大的组织中心部位得不到充分 固定。 尽管浸入固定有许多弊端，但因其操作简单方便，若 能较好掌握取材方法，如解剖动物动作尽可能迅速， 剪下的组织块尽可能小些，并尽可能快地放入固定液 等，也能得到较好的固定效果。故仍有许多组织样品 采取这种固定方式。例如皮肤和骨组织在血液供给停 滞后，可短时间保持其结构不变，较适合采用浸人固 定方式。 （1）动物组织固定 将动物麻醉或急性处死，解剖所需器官，用锋利洁 净解剖剪刀取下小块组织，放入预冷的2.5%戊二醛 固定液中 待组织稍硬后，用锋利的双面刀片将组织切成 lmmхlmmх3mm长条，而后切成小于lmm3小块并放 入固定液中，室温下固定1-2h。所用固定液剂量至 少是组织体积的5倍，甚至可高达10倍。 经2.5%戊二醛固定后，用0.lmol/L的磷酸盐缓冲液 (PBS)冲洗组织3次，每次15min， 然后用1%锇酸固定组织1~2h。 1)浸入固定 灌注固定需经血液循环途径，使所需组织或器官得到良好固定。如获取动物肝脏组织时，先将动物麻醉，解剖后使心脏和肝脏暴露，将注射器针头插人左心室，注入漂洗液，同时将右心房剪开，通过体循环冲洗大约30S，当肝脏从深棕黄色变成淡棕黄色时注入固定液，待组织适度变硬后，用剪刀取下一块组织，切成小块后放入预冷固定液。 2)灌注固定 为减少细胞物质丢失，取材后应立即进行固定和包埋等一系列操作程序。但在外科手术中意外获取的组织，手头又缺乏用于电镜样品制备药品和设备时，则需将组织材料暂时储存。 用于储存组织材料的固定液种类则取决于样品大小和研究目的。较小组织可短时间储存在醛类固定液中，大约3mm中等大小组织应放在4%甲醛和1%戊二醛固定液中;2~3cm较大组织材料需放在渗透效果较强的丙烯醛或甲醛固定液中，10%多聚甲醛0.2mol/L三甲基吡啶缓 冲液一般用于较大组织的固定，但这种固定液可能会抽提组织成分。已用醛类固定的组织材料不宜在缓冲液中储存。 3)组织暂时储存 单层培养细胞的固定，需倒掉培养瓶中的培养液， 加入2%戊二醛固定液后放在冰浴上3~5min。