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第四章 基因工程的常规技术(上）;基因工程常规技术;一、凝胶电泳技术;琼脂糖是一种线性多糖，从红色海藻琼脂中提取而来的良好的电泳介质，其密度是由琼脂糖的浓度决定的。分辨DNA片段的范围为0.2—50kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶：过硫酸胺与TEMED(N、N、N`、N`-四甲基乙二胺)是单体丙烯酰胺的催化剂和诱变剂，它们使单体丙烯胺聚合成长链，长链与长链间就交联成凝胶，链长和交联成决定了凝胶的孔径。分辨DNA范围为1个碱基对到1000个碱基对之间。;琼脂糖电泳的基本原理： 当一种分子被放置在电场当中时，它们就会以一定的速度移向适当的电极。电泳分子的迁移速度同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。;1. 琼脂糖凝胶电泳的原理;1. 琼脂糖凝胶电泳的原理;1. 琼脂糖凝胶电泳的原理;1. 琼脂糖凝胶电泳的原理;1. 琼脂糖凝胶电泳的原理;1. 琼脂糖凝胶电泳的原理;2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素;2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素;2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素;2. 琼脂糖凝胶电泳的影响因素;聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel)是由单体(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂(crosslinker)N,N’-甲叉双丙烯酰胺(N,N’-methylenebisacrylamide，简称Bis)在催化剂和加速剂作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。 用此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophorsis，简称PAGE)。;聚丙烯酰胺凝胶聚合机理是通过提供氧游离基的催化，使体系发生氧化还原作用来完成的。催化体系主要有化学催化（AP—TEMED）和光化学催化（核黄素——TMTED）体系。 （1）化学聚合（AP-TMTED催化体系）：TMTED是一种脂肪族叔胺，它的碱基可催化溶液中的AP使其形成游离氧自由基，激活Acr单体形成单体长链，同时在交联剂Bis的作用下长链彼此交联聚合成凝胶。 （2）光聚合：催化剂是核黄素，核黄素在光照下能够产生自由基，催化聚合反应。一般光照2－3小时即可完成聚合反应。;SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳是最常用的定性分析蛋白质的电泳方法，特别是用于蛋白质纯度检测和测定蛋白质分子量。;二、杂交技术;1. 探针与探针标记;1. 探针与探针标记;1. 探针与探针标???;随机引物法标记探针;2. Southern杂交;Southern杂交技术;Southern DNA印迹杂交X显像图片;３. Northern杂交;4. Western杂交;4. Western杂交;5. 菌落原位杂交;三、PCR技术;1. PCR技术的发现;但在发现耐热的Taq酶之前，PCR还不是成熟的技术。多种耐热聚合酶的发现，使PCR技术走向了每一个分子生物学的实验室。 目前PCR技术可扩增长达35-50kb的DNA片段。 PCR技术得到了快速的发展，在分子生物学研究中发挥着重要的作用。;2. PCR技术的基本成分;（1）模板;（2）DNA聚合酶;（3）引物;（4）四种脱氧核苷酸的混合物;（5）反应的缓冲液;3. PCR技术的原理和过程;指数增长;3. PCR技术的原理和过程;4. 荧光定量PCR;（1）内插染料