常用的分子生物学技术原理及应用().ppt

* Suzhou University * 寡核苷酸引物诱导突变 * Suzhou University * 2.Kunkel 定点诱变法 　由Kunkel,T.A.1985年建立 (1)将已插入目的DNA的M13 (RF)转化入 E.coli(dut-ung-)进行复制,子链中掺入了U； (2)与突变引物退火:取正链M13与突变引物退火; (3)制备异源双链：用Klenow酶，和T4连接酶 在体外合成异源双链； (4)将异源双链转化入野生型E.coli中，尿嘧啶脱 糖苷酶(Ung)降解含U的模板，仅含突变DNA的模板可得到扩增。 * Suzhou University * 酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选等等 2、常用蛋白质相互作用的研究技术 * Suzhou University * 1）酵母双杂交技术 * Suzhou University * 2）酵母双杂交系统的应用 （一）分析已知蛋白之间的相互作用 （二）对蛋白质功能域的分析 （三）分析未知蛋白相互作用 （四）绘制蛋白质相互作用系统图谱 （五）在药物设计中的应用 * Suzhou University * 2）荧光共振能量转移（FRET） 是比较分子间距离与分子直径的有效工具。FRET对距离和荧光基团的空间取向有高度敏感性，可以通过荧光能量转移效率的测量，观察生物分子间相互作用的改变情况，研究各种涉及分子间距离变化的生物现象，在蛋白质蛋白质相互作用研究、酶活性分析等方面有很重要的应用。FRET发生的基本条件是：供体D和受体A的距离必须达到一定的数量级（1-10 nm）；受体的吸收光谱必须与供体的发射光谱相重叠；供体和受体能量转移偶极子的方向必须近似平行。 * Suzhou University * 3） 噬菌体展示 很多重要分子间相互作用是发生在蛋白质(如细胞表面受体)和一种扩散性小分子(如配基)之间,酵母双杂交显得无能为力； 对这一类受体蛋白cDNA文库的筛选George Smith等发展了一种方法，用M13表达噬菌体衣壳融合蛋白,这种蛋白可以共价连接的方式附着在塑料盘子的底部。由于融合蛋白是在噬菌体的外侧表达的，是否能结合到塑料盘子上就可将噬菌体分开。 * Suzhou University * 方法： (1)将随机的多肽DNA弹夹(random peptide DNA cassette)插入到基因III的编码序列中，使在噬菌体颗粒的表面出现各种不同的蛋白质和多肽，即多肽文库。 (2)然后通过免疫吸附或亲和层析分离出特定的目标噬菌体。 (3)扩增阳性噬菌体。 (4)用ELISAs 进行分析鉴定。 * Suzhou University * * Suzhou University * * Suzhou University * 第九节　报道基因(Reporter genes) 通过检测mRNA转录本的水平或蛋白质的水平来了解基因的表达情况总是不方便的。 如通过检测大量的缺失和点突变及转染细胞来鉴别基因的调控顺序就更不方便。 利用报道基因可较容易地达到此目的。 报道基因能用来鉴定细胞，组织或顺式元件的短暂作用，或它对外来刺激(如激素)的反应。 * Suzhou University * 1、报道基因的条件 报道告基因编码的蛋白活性不能和靶细胞中已存在的某种蛋白相似。 所编码的酶的活性测定应快速，简便，灵敏，特异，且重复性好。 报道蛋白的功能不会干扰细胞的正常活性，如信号转递，代谢速率等。 * Suzhou University * 2、体外报道基因分析的方法 (1)氯霉素乙酰转移酶 (CAT) 它催化乙酰基从乙酰辅酶A上转移到氯霉素上，使氯霉素被乙酰化而失活，籍此来保护细菌。几乎所有的真核细胞中都没有相似的酶的活性。从转染细胞的提取物中用14C标记的氯霉素温育转染细胞的提取物和薄层层析可以很容易地分析CAT的活性。 但本法用同位素价格昂贵，CAT的稳定性也不理想。 * Suzhou University * pBasic pBasic pAMG pAMG pCMV pCMV 巨细胞病毒 多克隆位点 * Suzhou University * (2) 荧光素酶(Luciferase, luc) luc基因来自荧火虫(Photinus pyralia), Luc的底物是荧光素，催化反应需ATP，Mg2+。用一种特殊的设计的发光计可量度荧光素经ATP－依赖性Luc催化发出的荧光。 * Suzhou University * (3)?-葡糖醛酸酶 (?-glucuronidase,GUS) GUS是一种细菌的酶，在植物和哺乳动物细胞中都可用作报道基因，但因大多数