现代生物技术在植病研究中应用.ppt

第八章现代分子生物技术在植病研究中的应用 第一节免疫学（血清学）技术 抗原(Antigen) 是指一种能刺激人或动物机体产生抗体或致敏淋巴细胞，并能与这些产物在体内或体外发生特异性反应的物质。 抗原的基本能力是免疫原性和反应原性 只具有反应原性而没有免疫原性的物质，称为半抗原 抗原决定基( 表位) ●抗原决定基(antigenicdeterminant)或表位(epitope) 是指抗原性物质表面决定该抗原特异性的特殊化学基团。相当于钥匙的齿位。 抗体(antibody) 生物体在抗原物质刺激下，由淋巴细胞分化成的浆细胞所产生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白。 一. 抗体的制备 1. 多克隆抗体的制备 2. 单克隆抗体的制备 1. 多克隆抗体的制备 一般把免疫动物所产生的血清称为抗血清，因抗血清有含有多种不同的抗体，也叫多克隆抗体。 制备抗原 A. 真菌和细菌抗原的制备 B. 病毒抗原的制备 A. 真菌和细菌抗原的制备 细胞外抗原(Extracellular antigens) 可溶性抗原 (Soluble antigens) 细胞壁抗原(Cell wall antigens) 菌体抗原 B. 病毒抗原的制备 参考有关病毒的提纯的参考书。 免疫动物 多用小鼠、兔子、羊，也有用鸡、猪的报道。 实验室常用兔子，商品化产品多用羊。 血清制备过程示图 血清的分离与保存 2. 单克隆抗体的制备 基本原理 骨髓瘤细胞-无限制生长 B淋巴细胞-产生同种抗体 一个B淋出细胞只生产和分泌—种抗体分子 B淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合—不断地产生同种抗体 多克隆抗体与单克隆抗体的形成示意图 单克隆抗体的优点 1．高度同质性 2．高度特异性 3．无限量供应性 二 检测方法与用途 1. 酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked-immunosorbvent-assay ELISA ) 2. 免疫荧光(Immunofluorescence（IF）) 3 免疫金标记(Immunogold labelling) 4 琼脂双扩散(Ouchterlony double diffusion ODD) 酶联免疫吸附分析(ELISA ) 原理 1)微孔板表面可以吸附大分子物质 2)抗原和抗体可特异性结合 3)特异抗体与酶结合 4) 酶催底物生色 ELISA技术 ELISA技术中，还分为多种具体操作技术 竞争ELISA 非竞争ELISA 直接ELISA 间接ELISA 双抗夹心ELISA A. 间接ELISA： 第一步 用样品抗原包被微孔板， 第二步 封闭微孔板 第三步 加入特异抗体 第四步 加入带有酶标记的第二抗体(特异抗体的抗体) 第五步 加入显色底物 第六步 显色固定 第七步 读数(测定显色反应) B. 双抗夹心ELISA： 第一步 用兔抗体包被微孔板， 第二步 封闭微孔板 第三步 加入样品抗原 第四步 加入鼠抗体 第五步 加入酶标羊抗鼠抗体 第六步 加入显色底物 第七步 显色固定 第八步 读数(测定显色反应) 双抗夹心ELISA 在植病上应用的例子 在植病上应用的例子 1991 年,Lamka 等用抗体夹心ELISA 玉米枯萎病菌。 周雪平等(1996)建立 DAS-EL ISA 检测蚕豆萎蔫病毒(BBWV ) McGarvey, J. A.等（1999)检测EPS I（胞外多糖I） 梁巧兰等(2006) 建立 DAS-EL ISA检测百合CMV 韩丽君等(2005) 建立 ELISA 检测甲基对硫磷 鉴定盒(试剂盒) 现成的包被好抗体(抗原)的微孔板 现成的抗体，酶标物和其它试剂 市场出售 问题 1) 特异性 没有绝对的特异，交叉多少都会 存在 2) 灵敏度 组织背景会影响灵敏度 3) 内源酶 许多植物本身就含有过氧化物酶，或者磷酸酶 2. 免疫荧光(ImmunofluorescenceIF) 原理 类似ELISA，只是标记抗体用的是荧光染料，而不是酶。免疫荧光技术如同ELISA技术一样，可以进行定性和定量检测，用荧光计检测荧光的量。 用荧光镜观察荧光。 基本步骤： 荧光计检测 如同普通ELISA 组织定位观察 1 做片（石腊切片，冰冻切片，临时切片，涂片）和固定。 2. 加入特异抗血清 3. 加入荧光标记抗血清 4. 荧光显微镜观察 在植病真菌研究中使用免疫荧光（IF）技术 组织定位观察例子百合接种Botrytis elliptica 和Ulocladium atrum ？的叶横切片 组织定位观察例子病毒SPFMV编码的蛋白 组织定位观察例子青枯拉尔氏菌 的定殖与分