生化实验二--果蔬中总糖及还原糖含量的测定.ppt

生物化学实验 第一部分 果蔬成分的生化分析 综合实验一： 果蔬成分的生化分析 实 验 二果蔬中总糖及还原糖含量的测定 * * * * * 实验一 果蔬中维生素C的定量测定（4学时） 实验二 果蔬中总糖及还原糖含量的测定（4学时） 实验三 果蔬中蛋白质含量的测定（4学时） 实验四 果蔬中过氧化物酶分析（12学时） 实验材料： 冬枣＋柚子——1～4组 梨（2个品种）——5～8组 盘菜＋萝卜 ——9～12组 一、目的 掌握总糖和还原糖含量的测定方法。 学习分光光度计的原理和操作方法。 二、原理 总糖是指样品中的还原单糖及在本实验条件下能水解成还原单糖的蔗糖、麦芽糖和可部分水解成葡萄糖的淀粉。 多糖为非还原糖，可用酸将没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，再利用还原糖的性质进行测定，这样就可分别求出总糖和还原糖的含量。 蒽酮比色法是一个快速而简便的定糖方法。其原理：糖类在较高温度下可被硫酸脱水成糠醛或糠醛衍生物，再与蒽酮缩合成蓝色化合物，在620nm处有最大吸收。 三、实验器材 1、植物材料 2、吸管（1.0mL×2、5.0mL×2、 0.1mL×2 、0.2mL×2 、0.5mL×2 ） 3、试管（1.5cm×15cm×7） 4、分光光度计 5、水浴锅、电炉 6、电子分析天平 7、容量瓶（100mL×1）、玻璃漏斗 8、量筒、研钵、三角烧瓶 四、实验试剂 1、蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于1000mL体积分数为80%的硫酸中，当日配制使用。 2、标准葡萄糖溶液（0.1mg/mL）：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1000mL（可加几滴甲苯作防腐剂）。 3、6mol/L HCl溶液 4、20% NaOH溶液：称取20g NaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100mL。 五、操作 1、葡萄糖标准曲线的绘制： 取洁净试管6支，按下表进行操作： A620nm 煮沸10′，冷却后室温放置10′，在620nm处比色 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 蒽酮试剂 置冰水浴中5min 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 蒸馏水 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 标准葡萄糖溶液/mL 5 4 3 2 1 0 步骤 管号 以吸光度为纵坐标，各标准液浓度（mg/mL）为横坐标做图得标准曲线。 2、样品中还原糖的提取和测定 称取1g果蔬，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30mL蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温约0.5h（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100mL。过滤后冰箱保存。 冬枣、柚子、梨：取滤液1mL→100mL 盘菜、萝卜：取滤液10mL→100mL 吸取1mL滤液置于试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4mL蒽酮试剂，沸水浴中煮沸10min，取出冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同。测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。 3、样品中总糖的提取、水解和测定 称取1g果蔬，加水约3mL，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12mL蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10mL，搅拌均匀后在沸水浴中水解0.5h，冷却后用20%NaOH溶液中和至pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100mL，过滤后冰箱保存。 冬枣、柚子、梨：取滤液5mL用蒸馏水定容至100mL。 盘菜、萝卜：取滤液10mL用蒸馏水定容至100mL。 取总糖水解液1mL同上法进行还原糖测定。 六、计算 按照下列公式分别计算果蔬中还原糖和总糖的质量分数（w）。 W（还原糖）＝ ×100% C1V1 m W（总糖）＝ ×0.9①×100% C2V2 m ① 乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖中扣除水解时所消耗的水量。 式中： W（还原糖）：还原糖质量分数（%） W（总糖）：总糖质量分数（%） C1：还原糖的质量浓度（mg/mL） C2：水解后还原糖的质量浓度（mg/mL） V1：样品中还原糖提取液的体积（mL） V2：样品中总糖提取液的体积（mL） m：样品质量