Western-Blot-的原理-流程及常见问题分析.pptVIP

Western blot 流程和常见问题 高背景 信号弱或无信号 其 他 非特异性条带 * * 主要内容 一、Western Blot 技术原理与实验流程 二、Western Blot 技术常见问题分析 * * Western Blot定义 Western Blot又称免疫印迹，主要是通过电泳将样品中的不同蛋白分离开，然后将蛋白样品转移到固相载体上，利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。 Western Blot 应用目的： 检测样品中特异性蛋白质的存在 细胞中某种蛋白质的半定量分析 蛋白质分子的相互作用研究 Western Blot实验流程 * Step4 转膜 Step6 免疫反应 Step7 检测 Step2 蛋白定量 Step3 SDSStep1 蛋白提取 Step5 封闭 确定蛋白位置，选择合适的蛋白抽提试剂 防止蛋白质的降解 冰上操作 加入蛋白酶抑制剂 Bac-细菌蛋白抽提试剂 Mam-哺乳动物蛋白抽提试剂 Yea-酵母蛋白抽提试剂 Tis-组织蛋白抽提试剂 Nc-细胞核/浆蛋白抽提试剂 步骤一、蛋白提取 * * 步骤二、蛋白定量 Bradford 检测范围：100-1,500 ug/ml BCA 检测范围：20-2,000 ug/ml Lowry 检测范围： 1－1500ug/ml * BCA定量 在562nm处有高的光吸收值，颜色的深浅与蛋白浓度呈正比。 绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。 梯度稀释 步骤三、SDS电泳 * 上样前煮沸样品 上样量：30-100 μg 蛋白Marker * 步骤四、转膜 3 膜的选择： NC、PVDF、尼龙膜 转膜方法： 半干转、湿转 转膜确认： 立春红染色、蛋白预染Marker 膜的选择 * * 转移方法 半干转 用滤纸吸Buffer来做转移体系 适合转移小分子量的蛋白； 半干转的电流大小是按照面积来算的， 时间是根据 蛋白分子大小定的； 56mA/膜 1h 湿转 将膜、胶、滤纸全浸泡在Buffer的Tank里 适合转移大分子量（100KD以上）蛋白； 湿转电流是恒定的，时间也是根据分子量而定； 300mA 1h 转移操作 * +阳极 -阴极 多孔垫片 滤纸 凝胶 膜 滤纸 垫片 2层滤纸 膜（左上角标记） 凝胶（Marker靠左） 2层滤纸 垫片 黑色夹板（负极） 56mA /膜 1h 300mA 1h 白色夹板（正极） * 转膜后确认 丽春红 可逆染色，检测转膜效率。 与下游WB检测完全兼容，无任何干扰。 蛋白预染Marker 实时监测 分子量参照 与目的蛋白同时转移至印迹膜上，检测转膜效率。 对转膜后的凝胶进行考染 丽春红染色结果 * 步骤五、封 闭 去除非特异结合位点： Blocking Buffer ：3%BSA 5% Milk Room Temperature 1 h 一抗的选择 ： 确定所研究的目的蛋白，根据目的蛋白名称查询相关抗体。 抗体所检测的种属：人、小鼠、大鼠等 注意：抗体的稀释倍数是由底物和目的蛋白质的丰度决定的， 为了获得最佳实验结果，强烈推荐进行预实验，以确定具体的实验参数. 步骤六、抗体孵育 * * 步骤六、抗体孵育 二抗的选择： 抗小鼠 抗兔 抗大鼠 抗人 抗山羊 抗鸡 抗豚鼠 抗马 标记物 HRP、AP、Biotin、荧光标记、无标记 荧光标记抗体 红色 Cy3、TRITC、RRX、Texas Red X、Dylight549、Dylight 594、Dylight 649 绿色 FITC、Cy2、Dylight488 蓝色 AMCA 近红外线 Cy5 根据一抗物种： 根据标记物： 步骤七、检测方法 * 化学发光法： HRP酶标系统ECL鲁米诺（Luminol） 特点：无毒害、灵敏度高、速度快； 特异性好、节省抗体、线性宽； 可重新剥离检测。 化学显色法： 酶标系统HRPTMB和DAB 酶标系统APBCIP和NBT 特点：方便、便宜； 具有一定毒性、灵敏度较低、反应速度慢； 检测后的膜不可重新剥离检测。 * 推 荐 对照设置 内参对照 beta-actin /beta-tubu