基因工程第三章2-Jun-finalversion.pptVIP

第二节? 噬菌体载体 一、噬菌体的一般生物学特性 二、λ噬菌体载体 三、粘性质粒 四、单链DNA噬菌体载体 一、噬菌体的一般生物学特性 烈性噬菌体 温和噬菌体 溶源化细菌 溶源化 原噬菌体 λ噬菌体的电子显微镜照片 a) 在噬菌体内呈线性双链DNA分子(48502bp)，编码50多个基因，在两端各有12个碱基组成的5’单链互补粘性末端(Cohesive end),进入宿主细胞后,粘性末端连接形成环状分子(Cos位点)，是包装的必需DNA序列． 5’-GGGCGGCGACCTXX…XXG-3’ XX…XXCCCCGCCGCTGGA-5’ b) λ基因组DNA上有56种限制酶识别位点． 1. 野生型的λ噬菌体不适于直接用作基因克隆载体原因 λDNA基因组中同一种限制酶具有多个识别位点，不利于外源DNA插入—体内突变和建立新的克隆位点。 包装限制: λ噬菌体头部只能容纳自身DNA的75-105%，即39-52.5 Kb，天然λ仅可插入2.5Kb外源DNA片段—如若除去所有与λ裂解无关的基因和空白区，最大可插入22 Kb。 2. λ噬菌体的改造 切除非必需区段（重组基因簇）:1/3 非必需区段 切除必需的的RE识别位点，在非必需区引入合适的RE识别位点 引入适当的选择标记基因以便重组子的筛选 建立重组λDNA分子的体外包装系统，通过无意义突变将其改造成安全载体，以利于生物学防护。 2. λ噬菌体的改造 1) 除去多余的限制酶识别位点 天然的λ-DNA上有多个酶切位点，如：EcoRI 5个，HindIII 7个，这些多余的酶切位点必须被修饰。 一般利用自然选择法获得限制性位点缺失的λ品系。 自然选择法可以利用一个产生EcoRI的大肠杆菌，大部分侵入细胞的λ DNA分子会被限制性酶破坏，少部分能够成活，这些就是突变型的噬菌体，其EcoRI位点缺失了。 2. λ噬菌体的改造 2) 切除掉λDNA的非必需区 载体经改造后的长度约为40kb，但在非必需区域内含有两个相同的酶切口（如EcoRI、HindIII、或salI），两者间的距离为14kb长，使用时用酶切开，分离去除这个14kb长的DNA片段，然后用外源DNA片段取代之。 40-14kb=26kb包装下限为36.4kb，因此其载装下限为10.4而上限为25.5kb。 不再需要标记基因，因为空载的载体DNA只有26kb，不可能被包装，因而无法进入受体细胞中去 2. λ噬菌体的改造 3) 引入无义突变 琥珀型突变（sup)是指由CAG（Gln）向UAG（stop）的突变。大肠杆菌的某些菌株含有特异性的校正基因，其编码产物校正tRNA能专一性地纠正这一突变。 将野生型λDNA上D和E两个头部包装蛋白的基因中的CAG密码子突变成UAG。当这种λ DNA进入一般的大肠杆菌菌株后，不能合成有活性的头部蛋白，也就不能被包装和裂解细菌，这样就可以阻止有害重组体的生物污染及扩散，而基因工程实验中使用的受体则是具有琥珀型突变体校正功能的菌株。 3. 常用的λ噬菌体衍生载体 载体名称 分子大小(kb) 可克隆外源DNA片段大小(kb) Charon 3A 4.83 0 – 21.4 Charon 4A 　 4.54 　 0 – 20.1 Charon 17 4.64 0 - 22.4 Charon 20 40.36 0 – 21.37 Charon 21 A 41.7 0 – 21.08 Charon 28 39.39 0 – 20.05 Charon 30 46.76 0 - 20.24 LA 7 –1 40.6 0 – 24.1 Sep6-lac 5 44.3 0 – 22.4 BF 101 46 .0 6.3 – 24.4 插入型载体 只具有一个限制性核酸内切酶的酶切位点可供外源DNA插入的λ噬菌体派生载体 承载10Kb以内外源DNA片断 替换型载体(取代型载体) 具有两个限制性核酸内切酶的酶切位点，它们之间的DNA片断可被外源DNA片断取代 承载20Kb左右外源DNA片断 有多克隆位点，即可用作插入型又可用作取代型