重组基因的导入和鉴定.pptVIP

* * 噬菌斑原位杂交是将膜上结合的DNA进行变性、固定、杂交和放射自显影。将重组体中的DNA纯化出来进行电泳转移，可以检测重组体中与探针DNA同源的序列，这一方法称为“Southern印迹法”。 Southern印迹杂交是DNA的吸印转移，相应的还有只RNA相蛋白质的吸印转移，分别称为“Northern印迹杂交”和“Western印迹杂交”。 * * 四、免疫化学检测法 免疫化学检测法是利用抗体与抗原结合的高度特异性来鉴别基因的。如果某个重组克隆中的外源基因能够表达，在这个克隆中就存在着这个基因的特定蛋白，即可用特异性抗体来检测。常用的有标记抗体测定法和免疫沉淀测定法两种 。 * 四、免疫化学检测法 转化菌落 影印平板 置于含氯仿饱合气体的容器 细菌裂解，抗原释放 覆盖吸附有未经标记的抗体的NC膜 形成抗原抗体复合物 将NC膜与I125标记的抗体温育 放射自显影 与母板对照，挑取所需的重组克隆 标记抗体测定法的步骤： * 用免疫化学法检测克隆在表达载体pUC8上的基因 * 五、DNA-蛋白质筛选法 DNA-蛋白质筛选法(Southwestern screening)是专门设计用来检测同DNA特异性结合的蛋白质因子的一种方法。 用于筛选并分离表达融合蛋白质的克隆。合成此种融合蛋白质的重组DNA分子中的外源DNA序列，编码一种能专门同某一特定DNA序列结合的DNA结合蛋白质(DNA-binding protein)。 * 五、DNA-蛋白质筛选法 原理： 外源DNA 蛋白质 翻译 能与某一特定DNA序列结合 作为探针与克隆群体杂交 * .tw/bioware/BIOWARE%20-c/latest%20news/new08.htm * 1、共培养法(cocultivation) Marton等1979年以原生质体为受体建立，随后经过一系列的改进，现在是植物基因工程中最常用的一种转化方法。 主要原理是将受体与供体在一起培养，通过接触感染而发生转移，供体常用农杆菌、病毒载体等形式。 （一）载体介导的转化方法 * （1）原生质体共培养法 取含重组Ti质粒的农杆菌同刚刚长出细胞壁的原生质体作短暂的共培养，促使农杆菌和植物细胞之间发生遗传物质的转化。 1、共培养法(cocultivation) * ①从烟草无菌苗中分离原生质体，并预培养24小时。 ②原生质体与农杆菌混合培养，原生质体浓度l05／ml、农杆菌l07／ml，20℃下保温32小时。 ③冲洗去游离的细菌，将原生质体培养在有抗生素(250mg／L万古霉素，200mg／L羧苄青霉素，200mg／L链霉素)的培养基中，这些抗生素抑制细菌生长，而对原生质体无毒害。 ④3周后，离心收集细胞团，再培养在无激素培养基上，2周内，转化的细胞团是激素非依赖性生长细胞团，在该培养基中可快速生长，而非转化的细胞团则生长很慢，最后变褐死亡。 烟草原生质体与Ti质粒转移的共培养法程序为： * * （2）叶盘共培养法 该方法最早由Horsch(1985)首创，用于烟草转化 。 优点：适用性广，对于那些能被农杆菌感染的、并能从叶子再生植株的各种植物均适用。 * （3）悬浮细胞或愈伤组织共培养 原则上，该种共培养与原生质体共培养的方法和步骤是相同的，在供体上，则必须是有侵染和感染能力的载体系统，如带有Ti质粒的根癌农杆菌。 * 所谓整体植株接种转化法，是指人为地在整体植株上造成创伤部位，然后把农杆菌接种在创伤表面，或用针头把农杆菌注射到植物体内，使农杆菌按照天然的感染过程在植物体内进行侵染，获得转化的植物愈伤组织或转基因植株。接种后2-3周，切下接种处部分组织培养4周，可产生愈伤组织，进一步通过分化培养可获得转基因植株。 （4）活体接种(inoculation in vivo) * 2、病毒介导的基因转移 （1）双链DNA病毒转化载体 这类病毒是以双链DNA作为遗传物质，在这类病毒中，目前研究的最多的是花椰菜花叶病毒（简称CaMV, Caullinus Mozic Virus）。 （2）单链DNA病毒转化载体 GeNV顾名思义，可翻译成“双联体病毒”或“孪生病毒”。GeNV的感染范围较广，包括单子叶和双子叶植物，它们的传播媒介是昆虫。 （3）单链RNA病毒转化载体 迄今为止，还没有建立起一个完善的以植物RNA病毒为基因载体的基因转化体系，但是RNA病毒仍是一个很有希望作为基因工程载体的植物病毒。 * 3 花粉管通道 在授粉后向子房注射合目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而成为带转基因的新个体。 该方法于80年代初期由我国学者周光宇提出，我国目前推广