关于免疫组化封闭液原理的讨论.pptVIP

但个人认为并不全面，如果封闭仅仅是填补空隙的话，那封闭仅仅是起到降低背景的作用。如果是这样的话杂带的问题怎么解释呢？还有免疫组化的封闭是怎么个原理呢？ 个人觉得从抗原决定簇的角度来说可能会更好一点。抗体是识别抗原决定簇，然后与之结合，奶粉和BSA起封闭作用主要是通过蛋白起作用的，就是能够非特异性地将表面的抗原决定簇结合，这样特异性的抗体就不会跟这些非特异性的抗原决定簇结合，这样背景就会降低。 可能有人会问，那目的蛋白为什么不能被封闭掉？ 因为抗体跟目的蛋白的结合是非常特异的，结合能力很强，封闭之后依然能够结合。当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因。同样，通过延长封闭时间来去除非特性条带以及免疫组化中延长封闭时间降低背景都是这么个原理。 skykiller认为，封闭时的封闭蛋白不仅是吸附到膜上的空白位置（此点与zzz198506相同），而且还会和膜上已有的蛋白（目标蛋白和杂蛋白）产生竞争性的洗脱作用，而不是和膜上的蛋白产生结合作用。即不是用封闭液封闭杂蛋白的非特异性的抗原决定簇（用抗原决定簇这个词不是很妥当，但好理解一些），而是将杂蛋白从膜上部分洗脱下来，从而减轻了非特异性的条带信号。这种洗脱也会对目标蛋白产生作用，同样减轻其条带信号。 zzz198506的这句话：“当然如果封闭是太长，也能影响抗体的特异性结合，导致最后显影信号变弱，这就是有时候封闭时间长了信号变弱的原因”不能用结合来解释，但用洗脱就比较好理解。抗体与目标抗原的亲和结合常数远远高于这个zzz198506战友假说的非特异性结合，即使封闭液中的蛋白可能有与目标蛋白的非特异性结合，在抗体孵育过程中也会完全被替代，而不会影响到最后的显影信号。 用吸附-洗脱假说来看封闭的操作，就能明白为什么封闭液的组成、浓度、时间等等要素的对WB的影响。封闭液中要有可以和膜产生非特异性吸附的分子量适中的蛋白，太大了可能对邻近的目标蛋白产生位置阻碍，太小了容易从膜上的孔洞里脱落。封闭液的pH，盐，表面活性剂等一方面影响封闭液中的蛋白与膜的结合吸附，另一方面还会对膜上的已有的蛋白产生不同洗脱作用，这也是WB中选用不同封闭液的原因，即为了尽可能多的洗脱杂蛋白，尽量减少对目标蛋白的洗脱作用。封闭液的浓度越高，封闭时间越长，对膜上孔洞的覆盖越好，由于竞争性的作用，对杂蛋白的洗脱也越好，但对目标蛋白的洗脱也越强。也就是说在相同曝光条件下背景更干净，杂带更淡，但目标条带也更淡。 楼上说的都很精彩，借你们的文字和理论，我也自己总结一下，对错与否，恳请赐教。 1、转膜后蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于膜上，这种结合是很牢固的。 2、封闭液中的蛋白可以与膜上的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和“覆盖”蛋白结合位点以避免一抗的非特异结合，所以有“封闭”的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够很牢固的结合在空白位置上。 3、同时，封闭液中的蛋白与膜上的蛋白（抗原决定簇）进行非特异性结合，说明与目的蛋白也是有结合的。但这种结合强度不强，起码比1或2的结合方式要弱得多。 4、不排除“封闭液中的蛋白与膜上的蛋白存在一种竞争性洗脱作用，无选择性”。但应该说这种竞争是很微弱的，因为原来在膜上的蛋白和膜结合得很牢固，这种洗脱作用不至于对膜上蛋白的数量造成实质性影响。 5、一抗和目的蛋白的结合是特异性结合，这种结合力比较强。 6、结合能力比较：1＞2≥5＞3 7、理由： a、抗体洗脱液可以洗脱抗体，却不能洗脱膜上的蛋白，故2≥5。（另外，洗涤剂如免疫组化的PBS或wetern的TBST无法洗脱2和5、3这三种结合，只是洗去未结合一抗。因为在加二抗前有洗涤，如果能洗脱的话，二抗就会取代被洗掉的蛋白而与膜或其他蛋白产生非特异结合。所以，在封闭后也可洗涤也可不洗涤，但不洗会保险一点，因为在都封闭的情况下，一抗终究会取代封闭液中的蛋白。） b、1和2有着相同的结合方式，但1的机械填补是在电场的作用下完成的，综合起来认为1＞2。 c、一抗和目的蛋白的结合是特异性的，这种结合在封闭后进行就存在这一抗和封闭液中蛋白对目的蛋白的竞争，但这种竞争很不平衡，因为特异性结合比非特异性结合牢固得多（5＞3），也就是说一抗最终肯定取代封闭液中的蛋白结合在目的蛋白上；但毕竟是存在着竞争，所以一抗的取代不是完全绝对的，还受封闭液的浓度等因素的影响，因此，封闭液的不同会影响一抗和目的蛋白的结合率，也就解释了封闭时间长短，浓度会影响目的条带的现象。虽然这种影响很微弱。 8、最后，结合的强弱都是相对的，非特异条带的出现首要考虑一抗的特异性，其他只是辅助因素，只有衡量利弊，才能有合适的实验方案。 展开引用 leeo2636 wrote: