第三章应用微生物学技术.pptVIP

注意事项： ①高压汞灯打开后，需经10—15min才达到最大亮度。 ②制片要薄，太厚不易观察，深度的荧光物质不能被激发。 ③油浸用的油必须使用无荧光的液体石蜡或檀香木油等，香柏油本身产荧光。 ④一标区不宜连续观察3分钟以上，以免荧光猝灭。 ⑤镜检时，使用暗视野显微镜，让视野保持黑暗，可使荧光现象更加明显。 ⑥标本染色后，应当天观察，否则会褪色，或采用摄影记录保存。 3、应用 用以观察生物标本的固有荧光、染色剂荧光和免疫学荧光。 四、 光学显微镜样品标本的制作技术 1、细胞染色技术 　　　　　　　　简单染色法　　革兰氏染色法 　　　　正染色　　　　　　　　抗酸性染色法　　　　　　 　　　　　　　　鉴别染色法　　芽孢染色法　　 　　　　　　　　　　　　　 鞭毛染色法 荧光染色法 　　　　负染色：荚膜染色法等 2、活体观察技术 1）压滴法 2）悬滴法 3）插片法 3. 4. 3 电子显微镜技术 自1932年德国发明电子显微镜以来，发现了许多光学显微镜下看不到的新现象、新事实，开拓了超微世界，使得医学、生物学步入了分子生物学领域。目前电镜不仅可以观察一般细胞的超微结构，而且还可以探讨其分子结构；从一般超大型微细结构的定性观察，走向定量分析；从透射电镜超薄切片的平面观察，进入扫描电镜三维空间的立体表面观察、以及X线显微分析仪对微区进行的元素分析，这一些都由不同功能电子显微镜来完成。 一、 透射电子显微镜 一）原理 1、利用电子束代替光束作为照明源并穿透样品。 2、电子束的形成。 电压V ； 电子流υ ； 波长λ ； 两点间距 ； 当V为50-100kv时，λ为0.0054-0.0037nm 可见范围为2埃-2.5埃,是光学显微的1000倍，肉眼的一百万倍。 3、电子图像的形成 当电子束照射到样品上时，会出现一列四种情况 ①一部分电子从样品原子与原子之间的空隙中穿透过去。 ②一部分电子穿透时，会与样品原子核或原子的轨道电子发生碰撞，被散射开来。 ③一部分电子从样品表面被反射出来。 ④一部分电子被样品吸收后，样品激化而又从样品本身反射出来（二次电子）。 透射电镜收集的是透过样品的电子，这些电子束轰击荧光屏，在屏上现出光强差异的可见光图像。 由于物体不同部位的结构不同，它们散射电子的能力也各不相同。 样品质量、厚度 ；散射电子能力 ；透过光栏孔的电子数目 ；打在荧光屏上像的亮度 ；反之亦然，因而出现了明暗反差。 4、电子图象的放大 电子显微镜的放大率是由透镜决定的，而透镜是由看不见的电磁场构成，称为磁透镜。 电磁场强度 ； 放大倍数 ； 四）单细胞（单孢子）分离 单细胞（单孢子）分离法是采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养。 常用的仪器有：解剖显微镜（可对较大的细胞操作）、显微操作仪（可对较小的细胞操作） 五）组织分离法： 适于高等真菌或高等生物病原菌的分离 六）菌丝尖端切割 本法适用于长菌丝的霉菌，使用无菌解剖刀切割菌落边缘的菌丝尖端，并移种到合适的培养基上培养了新菌落。 四、 微生物菌种的性能鉴定技术 为了有效地进行筛选，必须一次或多次从现有菌群中，把多数无用的微生物淘汰掉，把少量的有用微生物筛选分离出来。 菌种的性能鉴定方法的选择应做到： ①快速：要尽快预测或预见出所筛选的目的微生物； ②敏捷：迅速处理好众多的样品； ③经济：通过一次筛选要得到具有广泛目标的有用微生物。 为提高性能鉴定工作效率，常选用平皿特异反应检出法。 1、透明圈法 透明圈法是利用能使混浊的底物被分解后形成透明圈的大小，检出微生物利用或消耗此物质的能力。 碳酸钙混在培养基中，可由透明圈的产生和大小确定微生物的产酸能力。 含酪素的培养基可由透明圈法选取出蛋白酶产生菌等。 2、变色圈法 变色圈法是直接用显色剂或指示剂掺入培养基中，或喷洒已生长菌落的培养基表面，使其形成显色圈而被检出。 可溶性淀粉的培养基可加碘着色观察透明圈分辨产淀粉酶产生菌等。 pH指示剂检测微生物产物中是否含有机酸或胺（酸或碱）。 3、生长圈法 生长圈法是利用某些具有特殊营养要求的微生物为工具菌，若分离的微生物能在一般