蛋白质的理化性质与分离纯化讲义.ppt

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS) SDS:是用SDS（十二烷基硫酸钠）和还原剂（通常为巯基乙醇）先对待分离的蛋白质样品进行预处理（加热煮沸3－5分钟）。 通过加热和SDS可以使蛋白质变性：多亚基的蛋白质解离为单亚基。二硫键被切断。 SDS是带有负电荷的分子，所有结合SDS的蛋白质的形状近似于长的椭圆棒，全部带上了大量的负电荷。 电泳时SDS-蛋白质复合物在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响（全部由负极向正极移动），而主要取决于蛋白质分子量。 浓缩胶 分离胶 样品 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 点样 浓缩胶 分离胶 样品 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳装置 电泳结果 每条带代表不同分子量的蛋白质或者肽段，这样蛋白质就分离开了 2.毛细管电泳 ① 泛指高效毛细管电泳、毛细管区带电泳、自由溶液毛细管电泳和毛细管电泳。 ② 用途：分离多种生物分子，包括氨基酸、肽、蛋白质、DNA片段（例如合成的寡核苷酸）和核酸以及多种小分子，如药物、甚至金属离子。用样量5～30μl 1mg/ml溶液。 3.等电聚焦电泳 等电聚焦或称电聚焦，是一种高分辨率的蛋白质分离技术，它也可用于蛋白质等电点的测定。 蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质（如浓蔗糖溶液）中进行电泳的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH梯度处，并形成一个很窄的区带。 等电聚焦可以把人的血清分成40多个条带。此技术特别适用于同功酶的鉴定。只要它们的pI有0.02（甚至0.02）pH单位的差别就能分开。 实际上是利用缓冲液在电场作用下在凝胶内沿电场方向制造一个pH梯度。所用的缓冲液是低分子量的有机酸和碱的混合物，该混合物称之两性电解质。 等电聚焦电泳装置 当蛋白质样品在这样的凝胶上电泳时，每种蛋白质都将迁移至与它的pI 相一致的pH处，具有不同pI的各种蛋白质最后都迁移至凝胶中相应的pH处，达到分离的目的。 4.蛋白质的双向电泳（two-dimensional electrophoresis） 将等电聚焦电泳与SDS结合起来的电泳技术。 电泳方向 电泳方向 等电聚焦电泳 SDS双向电泳后的凝胶经染色蛋白呈现二维分布图，水平方向反映出蛋白在pI上的差异，而垂直方向反映出它们在分子量上的差别。 所以双向电泳可以将分子量相同而等电点不同的蛋白质以及等电点相同而分子量不同的蛋白质分开。 是根据蛋白质的等电点差异分离蛋白质混合物的柱层析方法。 特种多缓冲交换剂 PH 降低 混和蛋白质样品 特种多缓冲液 特种多缓冲液 收集 特种多缓冲液 收集 特种多缓冲液 依次收集不同的蛋白组分 5.层析聚焦(P310) 填充到层析柱中的树脂有阳离子交换型和阴离子交换型。 支持介质： 对蛋白质交换容量大 阳离子交换剂 阴离子交换剂 CM—纤维素(弱酸型) P纤维素(中强酸型) SE 纤维素(强酸型) SPSephadex(强酸型) AM—纤维素(弱碱型) PAB--纤维素(弱碱型) DEAE-纤维素(中强碱型) DEAE-Sephadex(中强碱型) TEAE-纤维素(强碱型) QAESephadex(强碱型) 6.离子交换层析(P310) 以阳离子交换型树脂为例 　将带有耐酸性非常强的磺酸根SO3-Na＋（以盐的形式出现）的强阳离子交换树脂（固定相）填充到层析柱中。 　将含有样品的流动相加入层析柱中，样品中带有正电荷的蛋白质X，通过静电吸引，与树脂中的带电基团相互作用，结果X与Na＋交换（阳离子交换），形成SO3-X，蛋白质就结合到了层析柱上。 　在样品与树脂充分交换后，可通过提高流动相中的盐浓度，或改变流动相的pH，或是同时采用这两种方法，就可以将结合于树脂上的蛋白质X成分，按照它们与树脂结合的强弱程度不同逐一地洗脱下来。 结合到层析柱上的蛋白质的洗脱有不同的洗脱方式： 洗脱方式 恒定浓度洗脱 改变盐浓度或pH洗脱 跳跃式分段洗脱 渐进式连续改变(梯度洗脱) 简单型混合器 复合型混合器 利用待纯化的分子和杂质分子与吸附剂之间的吸附能力和解吸性质不同而达到分离目的。 典型的吸附剂：硅胶,氧化铝和活性炭等. 　 主要用来分离非离子、水不溶性化合物 （四）利用选择性吸附的纯化方法(P312) 亲和层析(affinity chromatography)：是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力, 即生物学亲和力，建立起来的一种有效的纯化方法。 经常只需一步处理即可将某种所需蛋白质从复杂混合物中分离出来，纯度相当高。 (五) 利用与配体的特异生物学亲和力的纯化方法(P313) 二、蛋白质的分离纯化方法 主要是根据蛋白质在溶液中的性质不同对蛋白质进行分离。 分子大小 溶解度 电荷 吸附性质 对配体分子的生物学亲和力 （一）根据蛋白质分子