细胞培养细胞计数与转染.pptVIP

细胞培养 Cell culture 体外培养细胞的特性 培养细胞的生长方式 贴附生长：必须贴附于支持物表面才能生长。见于各种实体瘤细胞。 悬浮生长：于悬浮状态下即可生长，不需要贴附于支持物表面。见于各种造血系统肿瘤细胞。 细胞培养基本概念 原代培养 动物或人组织直接用蛋白酶消化所得的细胞经体外培养后可贴壁或悬浮生长，在传代之前称为原代培养。 传代 细胞在培养器皿中生长一定时间后，被分开接种到新的培养器皿中。 细胞系 cell line 原代培养物成功传代后，则称之为细胞系。如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（finite cell line）；已获无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（infinite cell line）。无限细胞系大多已发生异倍化，具异倍体核型，有的可能已成为恶性细胞，因此本质上已是发生转化的细胞系。 细胞株 cell strain 从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株。通常将具有特殊性质或标志物的细胞群称为细胞株。 每代贴附生长细胞的生长过程 游离期 贴壁期 潜伏期 对数生长期 停止期（平台期） 游离期： 细胞接种后在培养液中呈悬浮状态．也称悬浮期。此时细胞质回缩，胞体呈圆球形。 10分钟一4小时 贴壁期： 细胞附着于底物上，游离期结束。细胞株平均在10分钟一4小时贴壁。 底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等 血清中有促使细胞贴壁的冷析球蛋白和纤粘素、胶原等糖蛋白（生长基质），这些带正电荷的糖蛋白的促贴壁因子先吸附于底物上，悬浮细胞再与吸附有促贴壁因子的附着。 进口塑料培养瓶涂有生长基质（化学合成的功能基团） 潜伏期 此时细胞有生长活动，而无细胞分裂。 细胞株潜伏期一般为6～24小时。 对数生长期： 细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳，最适合进行实验研究。 停止期（平台期）： 细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂 机制：接触抑制、密度依赖性 细胞培养方式 群体培养（mass culture），将含有一定数量细胞的悬液置于培养瓶中，让细胞贴壁生长，汇合后形成均匀的单细胞层 克隆培养（clonal culture），将高度稀释的游离细胞悬液加入培养瓶中，各个细胞贴壁后，彼此距离较远，经过生长增殖每一个细胞形成一个细胞集落，称为克隆（clone）。一个细胞克隆中的所有细胞均来源于同一个祖先细胞。 培养细胞生长的条件 无污染环境: 生物安全柜，超净工作台 基质: 玻璃，塑料… 营养需要: 氨基酸，碳水化合物，无机盐，缓冲系统，维生素 … (商业化合成培养基) pH: 7.2-7.4 温度: 37 ℃，细胞培养箱 气体环境 O2 CO2: 5% CO2 +H2O ← →H2CO3 ← →H+ + HCO3- 实验准备 实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸，紫外灯，甲醛熏蒸器 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动移液器，培养板， 冻存管 。。。 超净台 CO2培养箱 培养瓶 滤 器 实验物品准备 常用玻璃器皿清洗 浸泡（自来水）、刷洗（洗衣粉）、泡酸（24小时）、 流水冲洗、蒸溜水浸泡和冲洗、50℃烘干 清洁液的配制 细胞培养用液的配制 水：新鲜配置的三蒸水或去离子水 平衡盐溶液：无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 消化液 胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。 胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。 胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％ 。用滤器过滤除菌。 胰蛋白酶液消化时间：2-10分钟。 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 培养基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养