MALDI-TOF-MS病原体鉴定质量保证专家共识.docVIP

MALDI－TOF MS病原体鉴定质量保证 专家共识 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption ionization time－of－flight mass spectrometry, MALDI－TOF MS)作为一种新兴的软电离质谱技术，由于其具有快速、准确、灵敏、自动化及高通量等检测特点，已成为一项革命性病原体快速鉴定技术被用于临床微生物实验室，并将逐步取代常规病原体生化鉴定方法。任何新兴技术应用于临床都需要建立规范的质量保证体系，以确保检测质量。本专家共识将对开展MALDI－TOF MS用于病原体鉴定的设施与安全要求、人员培训与能力评估、MALDI－TOF MS病原体鉴定过程的质量控制、检验程序性能验证等进行建议。 设施与安全要求 1．风险评估： 拟开展MALDI－TOF MS病原体检测的实验室需在风险评估基础上建立有效的安全防护策略，包括设备的使用、化学试剂的安全使用和处理丢弃、感染性病原体和被污染材料的处置等。风险评估包含确定工作流程和鉴定步骤中可能发生的化学和生物危害，以及降低风险的方法。 2．安全防护： 任何操作临床病原体样本或病原体的实验活动至少需要在二级生物安全实验室(BSL－2)中进行。MALDI－TOF MS应安置在二级生物安全实验室内，同时使用MALDI－TOF MS检测临床病原体样本时除了需考虑生物危害的风险外还要注意化学试剂的潜在风险。 人员培训与能力评估 各实验室应具备MALDI－TOF MS检测过程中涉及的所有操作人员的初次培训和定期能力评估的程序文件，对涉及的所有操作人员应进行初次和定期(至少6个月一次)的培训以及能力评估，培训考核需遵循制造商的使用手册或实验室的标准操作规程，培训的内容包括原理方法、信息技术、仪器维护、结果报告与解释等方面。此外，还应采用一组形态和生化特征典型的菌株对培训者进行人员比对和/或考核，以确保所有操作者鉴定结果的一致性。通过培训，要求每位操作人员对每种病原体的鉴定结果必须达到本实验室设定的每种病原体的最小结果阈值。保存所有培训、考核和能力评估记录。 建议1　对于临床常见细菌(非高致病)，操作人员的个人防护应按标准预防要求，其病原体分离培养、蛋白提取及靶板点样时应在生物安全柜内进行，点样后的靶板转移至MALDI－TOF MS，分析过程中也需注意生物安全防护；对潜在的含生物危害二类及以上的高致病病原体如布鲁菌、炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌等的临床样本，实验室人员应请示医院感染管理部门并尽量避免培养检测，必要情况下需要在生物安全柜内采用经灭活程序灭活后再进行质谱分析。 建议2　前期的样本处理过程中将会使用一些有机溶剂如乙醇、甲酸、乙腈、三氟乙酸和基质液等，这些溶剂具有腐蚀性或可燃性，可引起人体皮肤黏膜腐蚀、呼吸及循环系统功能紊乱、多脏器损伤，因此在实验的过程中使用此类有机溶剂试剂时建议有一个良好的通风环境，同时需加强操作人员的呼吸道、皮肤黏膜尤其是眼面部的个人防护。 MALDI－TOF MS 病原体鉴定过程的质量保证 质量保证可确保MALDI－TOF MS病原体鉴定结果的准确性和及时性，其内容涵盖分析前、分析中和分析后。 (一)分析前 1．菌株准备： 所有菌株均采用新鲜培养(16～48 h)的单个菌落，推荐细菌采用血琼脂平板培养，真菌采用沙保罗平板培养，冻存菌株传代两次后使用。 2．靶板点样： 先将质控菌株/蛋白标准品点在靶板相应孔位，再点待测菌落。点样时应注意菌量适当、厚度均匀，不可带有琼脂成分。 3．加基质液： 点样后加入基质液，应自然凉干。 4．特殊病原体： 如分枝杆菌、丝状真菌和诺卡菌等需要通过蛋白提取法进行提取前处理，包括使用甲酸、乙腈、破壁硅珠管等试剂耗材。详细处理过程建议参考制造商提供的SOP进行操作。 5．样本准备注意事项： (1)靶板点样加入基质液后，需完全干燥形成结晶方可进行检测。(2)靶板准备完成后，如为细菌或酵母菌，需在48 h内完成检测；如为分枝杆菌，需在4 h内完成检测；如曲霉菌等丝状真菌，需立刻完成检测。 (二)分析中 一般情况下，MALDI－TOF MS检测可以得到以下几种鉴定结果：(1)高置信的鉴定结果；(2)多个鉴定结果，且每个结果的置信度相似；(3)无鉴定结果。 1．结果判断： 当MALDI－TOF MS提供了高置信的结果时，无需对图谱进行检查和复核；而当出现多个鉴定结果或无鉴定时，可能出现以下问题：(1)低质量的图谱导致无鉴定结果：需检查菌株和试剂耗材的质量、仪器性能状态以及具体操作环节；(2)图谱质量较好而不符合预期的鉴定、多个鉴定结果或者无鉴定结果：应检查样本是否分纯、是否污染或数据库不包含待检菌种。 2．结果阈值： 目前MALDI－TOF MS的结果阈值通常分为两种：一种以