乳酸脱氢酶作用实验报告.docxVIP

乳酸脱氢酶的作用实验报告 　　实验八乳酸脱氢酶同工酶的琼脂糖凝胶电泳　　一、实验目的　　了解琼脂糖凝胶电泳的方法和原理，学会分离LDH同工酶的方法。　　二、原理　　同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子的结构理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶，同工酶这种差异是由于酶蛋白的编码基因不同或基因相同但转录、翻译或后加工有别所造成的。同工酶存在于生物的同一种属或同一个体的不同组织，甚至同一组织或细胞的不同亚细胞结构中。　　人们已发现几百种同工酶。乳酸脱氢酶是人们认识的第一个同工酶。LDH是糖酉孝解中的一个酶，它催化的反应如下。COOHCOOH　　HO——H+NAD＋　　＝O＋NADH＋H+　　CH3CH3　　LDH有五种同工酶，分子量在13万～15万之间，由四个亚基组成。LDH的亚基有两种类型，一种是心肌型亚基，另一种是骨骼肌型亚基。两类亚基以不同比例可组成五种四聚体。即LDH1(H4)、LDH2(H3M1)、LDH3(H2M2)、LDH4(H1M3)、LDH5(M4)。H型亚基与M型亚基的氨基酸组成有差异，前者含酸性氨基酸残基多，故LDH可用电泳的方法进行分离。本实验用的缓冲液，在此条件下电泳，LDH的五种同工酶均净带负电荷，向正极泳动，但LDH1最快，依次减慢，LDH5最慢。　　在哺乳动物体内，一般厌氧性组织中，如骨骼肌、肝脏中，LDH5含量高；在非厌氧性组织中，如心、脑中，LDH1含量高。　　本实验用琼脂糖凝胶，LDH的五种同工酶在琼脂糖凝胶板上分离后，进行酶促反应，使乳酸脱氢生成NADH，NADH将人工递氢体PMS还原，还原型PMS最终将NBT还原。　　NADH++H++PMS=====NAD++PMSH2　　PMSH2＋NBT======PMS＋NBTH2　　NBTH2为蓝色化合物。　　三、实验器材　　、仪器　　1、电泳仪　　1、水平电泳槽　　2、离心机　　3、玻璃匀浆器　　5、恒温箱　　6、微量移液器　　7、吸量管　　四、材料与试剂　　1、小白鼠　　2、白瓷盘　　3、剪子　　4、镊子　　5、载玻片　　6、滤纸　　7、生理盐水　　8、/l磷酸钠缓冲液：取/LNaH2PO419ml和/LNa2HPO481ml混合即可。　　9、/l巴比妥钠盐缓冲液：称取巴比妥钠，巴比妥，加蒸馏水溶解并稀释至1000m1，pH为。　　10、％琼脂糖：琼脂糖，巴比妥钠盐缓冲液50ml，蒸馏水48ml，10mol/lEDTA2ml，水浴加热溶解。　　11、染色液：取LDH酶活性染色液，％琼脂糖混匀，临用前10分钟配制，避光保存37℃恒温箱内。　　+12、LDH酶活性染色液：、、、1mol/l乳酸钠、/lTris缓冲液、/lNaCl、加双蒸水25ml。　　13、脱色固定液：95％乙醇140ml、1％或5％冰乙酸10ml、蒸馏水50ml。　　五、实验步骤　　、LDH的提取　　取成年小白鼠断头杀死，任取下列组织：心、肝、肾、脾、肺、胃、肠、舌、骨骼肌和性腺，用生理盐水洗去血迹，称取以上组织克加20倍体积/lNaPB，用玻璃匀浆器在冰浴上匀浆，匀浆经3000rpm离心20min，取上清液用于电泳分析。　　、凝胶的制备　　取溶化的％琼脂糖，加至干净的载玻片上，凝固后即可使用。　　、加样　　将普通滤纸剪成12×的细条，用微量移液器取LDH提取液10－15μl，将剪好的滤纸条充分浸润后，平贴在距载玻片一端的约1/3处。　　、电泳　　将凝胶板移入平式电泳槽内，点样端在负极，加入巴比妥钠盐缓冲液，两端用四层已浸透缓冲液的纱布“搭桥”。电压120V，通电40－45min。　　、染色与固定　　电泳完毕，每块凝胶板上立即加上预先配制好的染色液，均匀覆盖，于37℃恒温箱内保温30－60min，至有清晰的蓝紫色带区出现。　　将凝胶板放入5％乙酸中固定30min，再用蒸馏水漂洗2－3次，待背景无色后，即可用于定量或扫描等处理。　　图1LDH同工酶PAGE活性染色示　　意图　　1、正常人血清2、猪心提取液3、　　猪骨骼肌提取液　　六、注意事项　　1、LDH属于胞内酶，通过匀浆破碎细胞释放出LDH，像肌肉、胃、肠等较难破碎的组织，匀浆时间可适当延长。　　2、铺板时应注意将载玻片放平，用吸量管吸取溶化的琼脂糖，一次放入载玻片中央，让其向四周扩展，这样形成的胶面光滑平整。　　3、浸润LDH提取液的滤纸条，要用镊子夹住贴在据载玻片一端的1/3处，注意与载玻片一端平行。　　参考文献　　1、张龙翔、张庭芳、李令媛，生化试验方法和技术，高等教育出版社，19972、袁玉荪、朱婉华、陈钧辉，生物化学实验，高等教育出版社，1988　　3、刘粤梅、朱怀荣，生物化学实验教程，1