分子生物学导论2 DNA复制.ppt

* Summary 1. 整个染色体在每个细胞分裂循环中复制一次。细菌染色体包括单个复制子，但真核染色体具有许多复制子。 2. E. coli原点包括~245bp，双向起始复制。两个复制叉离开原点沿着染色体移动，直到它们相遇，引起复制叉相遇后终止复制的序列已被发现。 3. 滚环是环状DNA 分子复制的另一种形式，复制时原点被切割从而提供引物端。DNA的一条链从这一末端合成，替代原有的互补链。这一过程继续循环会产生多聚染色体。 * * 1 DNA的半保留复制模型 2 复制的单位-复制子 3 DNA的复制 4 与DNA复制有关的蛋白质 5 DNA复制的调控 本次内容 * * 1、DNA聚合酶 原核DNA聚合酶I、II、III 聚合酶I 聚合酶II 聚合酶III 3’→5’外切 + + + 5’→3’外切 + - - 新生链合成 - - + 细胞内分子数 400 10～20 生物学活性 1 0.05 15 E Coli DNA聚合酶I、II和III的性质比较 * * 1、都以dNTP为底物。 2、都需要Mg2+激活。 3、聚合时必须有模板链和具有3‘—OH末端的引物链。 4、链的延伸都方向为5→3。 DNA聚合酶的共同点 * * * * * 核酸内切酶(Endonucleases)核苷酸链中切割键、在RNA。单链或者双链DNA 核酸外切酶(Exonucleases) 从多聚核苷酸链末端一次切除一个碱基。 图2.22 修复合成置换受损的DNA链。 Arthur Kornberg Discovered an enzyme in E. coli that could catalyse the synthesis of DNA ?He called it DNA Polymerase ?Now known as DNA polymerase I ?Four other DNA polymerase enzymes in E. coli ?1959 -Nobel prize in Physiology or Medicine * * * * * DNA聚合酶Ⅰ，103 kD的单链多肽，可被切成两个区域。 68 kD片段称为Klenow片段，可在体外用于DNA合成。它具有DNA聚合酶活性和3’-5’外切酶活性。该蛋白质C端的2/3区域含聚合酶活性位点，同时N 端的1/3 部分含校正外切核酸酶活性。 小片段(35 kD)具有5’-3’外切酶活性。此活性与合成/校正活性互相协调。使DNA聚合酶Ⅰ在体外具有从切口处起始复制的独特能力(其它DNA聚合酶均无此能力)。 DNA聚合酶I不是复制大肠杆菌染色体的主要聚合酶，它有5’→3’核酸外切酶活性，保证了DNA复制的准确性。它也可用来除去冈崎片段5端RNA引物，使冈崎片段间缺口消失，保证连接酶将片段连接起来. * * Klenow片段  Klenow片段：E.coli DNA聚合酶I经部分水解生成的C末端605个氨基酸残基片段。该片段保留了DNA聚合酶I的5ˊ-3ˊ聚合酶和3ˊ-5ˊ外切酶活性，但缺少完整酶的5ˊ-3ˊ外切酶活性。 E.coli DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段是完整的DNA聚合酶Ⅰ的一个片段，只有在5’→3聚合酶活性和3’→5’外切酶活性，失去了5’→3外切酶活性。它可用于填补DNA单链末端成为双链。如果供给32P标记的三磷酸核苷酸，则可使DNA带上同位素标记。 当用交错切割的限制酶切成带有单链粘性末端的DNA片段，要用被切成平头末端的DNA片段连接时，可以先用Klenow片段使粘性末端的单链补齐成为平头，然后在DNA连接酶作用下把两个DNA片段连接起来。 * * 缺口移位（nick translation） 该原理是首先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口,缺口处会形成3’—羟基末端，这时再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上，同时，根据大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，此酶将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果是缺口平移。根据这个原理，如果用高强度的放射性核苷酸置换先前存在的核苷酸，则可制备32P标记DNA探针。 DNA聚合酶II的活性很低，若以每分钟酶促核苷酸掺入DNA的转化率计算，只有DNA聚合酶I的5%，所以也不是复制中主要的酶。目前认为DNA聚合酶II的生理功能主要是起修复DNA的作用。 * * DNA聚合酶III包含有7种不同的亚单位和9个亚基，其生物活性形式为二聚体。它的聚合活性较强，为DNA聚合酶I的15倍，聚合酶II的300倍。它能在引物的3’—OH上以每分钟约5万个核苷酸的速率延长新生的DNA链，是大肠杆菌DNA复制中链延长反应的主导