蛋白质组学医学培训课件.ppt

一、蛋白质组学概述 结构蛋白质组学和功能蛋白质组学 相互作用蛋白质组学 亚细胞蛋白质组学 翻译后修饰蛋白质组学 …… 二、蛋白质组研究的技术路线和相关技术 1、 蛋白质提取 理想的蛋白抽提方法：蛋白充分溶解、充分变性、 充分还原。 常用的植物蛋白抽提方法： TCA/丙酮法沉淀法 酚抽提法 TCA/丙酮法沉淀+酚抽提法 分步抽提法（根据蛋白溶解性不同）： 提高双向电泳分辨率 提高低丰度蛋白的检出 富集膜蛋白 样品缓冲液的成分和作用 尿素：8-10M，使蛋白质变性 去污剂：兼性离子去污剂，溶解膜蛋白。CHAPS，NP-40 Tris缓冲液 DTT 2、双向电泳 双向电泳的优缺点 优点： 固化PH梯度胶的应用提高了重复性和分辨率 胶内加样，使上样量大大提高 扩展了IPG胶条的PH范围，使碱性蛋白得到分离 线性和非线性PH梯度胶条的使用，提高了特异区域的分辨率 窄范围和非常窄范围PH胶条，可提供2-3或1个PH单位范围 胶条长度的改进（7, 11, 13, 18, 24cm, 40cm） 3、蛋白质斑点显示 4、图像采集和软件分析 5、蛋白质鉴定 三、蛋白质组学必威体育精装版进展 2、 大规模蛋白质分离与鉴定的多维色谱-质谱联用技术(MDLC/MS) 基于质谱的蛋白质组学 常用的是离子交换层析和反相层析 基本过程： 3、相互作用蛋白质组学的酵母双杂交技术 全面详尽的蛋白质相互作用图谱称为互作组(interactome) 4、蛋白质芯片技术 关键因素： 5、 蛋白质翻译后修饰的鉴定 蛋白质翻译后修饰 300多种，重要的有磷酸化，糖基化，乙酰化，烷 基化和泛素化等。 质谱应用于鉴定蛋白翻译后修饰的进展较慢 修饰肽段化学计量值低，肽段信号丰度低 富集修饰肽段的技术提高了检测的灵敏度和选择性 RP-HPLC-MS/MS；IMAC-MS/MS * * * * 蛋白质组学 蛋白质组是指由一个细胞或一个组织的基因组所表达的全部相应的蛋白质。 蛋白质组学(Proteomics)则是采用大规模蛋白质分离和鉴定技术对不同时空发挥功能的蛋白质组的研究, 从蛋白质水平上探索蛋白质作用模式、功能机理、调节控制以及蛋白质群体内相互作用的学科。 protein genome proteome Gene(genome) mRNA(transcriptome) Protein(proteome) peptides hn-RNA 转录 转录后加工 翻译 翻译后加工 多级调控 时空性，可调节性，多样性 整体性，同步性，高通量 1、蛋白质提取 2、双向电泳 3、蛋白质斑点显示 4、图象采集和软件分析 5、蛋白质鉴定 蛋白 提取 双向电泳 图像分析和 数据处理 Edman 降解 生物质谱 数据库检索 蛋白鉴定 分析软件 酶解 氨基酸分析 PMF PST 功能分析 组织 基于胶的蛋白质组技术 peptide mass fingerprint peptide sequence tags 3 复杂变化的差异部分放大图 Mr 15.0 20.0 30.0 40.0 50.0 70.0 100.0 pI 4.5 5.1 5.5 5.9 6.6 7.0 8.5 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 植物组织+TCA丙酮+还原剂 研磨 -20℃提取 离心 沉淀 上清液 （弃） 冷冻干燥 粗提蛋白质干粉 溶解于双向电泳缓冲液 +蛋白酶抑制剂+还原剂+DNase+RNase 4 ℃提取 离心 沉淀 上清液