中南大学分子生物学课件第七章 基因结构与表达分析的基本策略.pptVIP

第七章 基因结构与表达分析的基本策略 概 论 1. DNA双螺旋结构发现 （Watson ＆Crick,1953） Presentation Speech by Professor A. Engstr?m Dr. Francis Crick, Dr. James Watson, Your discovery of the molecular structure of the deoxyribonucleic acid, the substance carrying the heredity, is of utmost importance for our understanding of one of the most vital biological processes. Practically all the scientific disciplines in the life sciences have felt the great impact of your discovery. The formulation of double helical structure of the deoxyribonucleic acid with the specific pairing of the organic bases, opens the most spectacular possibilities for the unravelling of the details of the control and transfer of genetic information. 讲授内容： 一、DNA序列分析 （一）双脱氧链末端终止法※ (Sanger ,1977) （二）化学裂解法 (Maxam ＆Gilbert ,1977 ) （三）DNA自动化序列分析 (Sanger, UK (一）双脱氧链末端终止法（dideoxy chain termination） 以DNA合成 反应为基础。 （三）DNA测序自动化原理 采用4种不同的荧光分别标记4种ddNTP终止反应产物，替代放射性同位素标记是实现DNA测序自动化的基础。 1. DNA自动测序步骤： 4种带有不同荧光染料标记的终止物ddNTPs 荧光信号采集、计算机分析与DNA自动排序。 2. DNA自动测序结果 (Ⅱ)核酸分子杂交 Nucleic Acid Hybridization ● 细胞原位杂交 （Pardue et al， 1969) ● Southern印迹杂交※: 检测DNA （Southern EM ，1975） ● Northern印迹杂交※: 检测RNA （Stark GR，1977） 核酸分子杂交原理 一、Southern印迹杂交(Southern blot hybridization) 将电泳分离的待测DNA片段结合到一定的固相支持物上，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程。 二、Northern印迹杂交(Northern blot hybridization) 指将RNA变性及电泳分离后，并转移到固相支持物上，用杂交反应来鉴定其中特定mRNA分子的含量及其大小。 三、其他杂交技术 (一)斑点杂交 (dot blot hybridization）: （二）原位杂交（in situ hybridization） （三）液相杂交 (solution hybridization) 1．核酸酶S1 保护分析法 (nuclease S1 protection assay） 单链DNA探针与待测RNA形成DNA/RNA杂交双链，加入核酸酶S1专一性地降解未形成杂交体的DNA或RNA单链，DNA/RNA杂交双链则受到保护而不被降解。 2．RNA酶保护分析法 （RNase protection assay，RPA） RPA基本程序： ●待测RNA的分离 ●体外转录标记RNA探针 ●待测RNA与探针RNA进行液相杂交 ● RNA酶消化 ●不同大小杂交片段凝胶电泳分离 3.抑制消减杂交原理（suppression subtractive hybridization，SSH） 以杂交为基础，并与PCR技术结合的cDNA消减杂交方法。 (Ⅲ) 基因芯片和微阵列 cDNA Chip and Microarray ● 基因芯片上的阵列是由有