JAP-017 吡利霉素检测方法.pdf

吡利霉素检测方法 1．分析目标化合物 吡利霉素（对于肝脏，吡利霉素和吡利霉素亚砜） 2．仪器设备 液相色谱—质谱仪。 3．试剂 除下列试剂外，使用附录2所列试剂。 盐酸吡利霉素一水合物标准品：含盐酸吡利霉素一水合物97%以上，熔点为210.5 ℃～ 212.5 ℃。 二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（60 mg）：内径12～13mm 聚乙烯 管中填充60mg二乙烯基苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物或具有同等分离特性的 物质。 4．試验溶液的制备 1) 肌肉 ①提取方法 尽可能除去脂肪层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。加入100 mL甲醇：0.2% 偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，搅拌后，用涂布2～3 mm 厚硅藻土的滤纸抽滤于磨 口减压浓缩器中。取出滤纸上的残留物，加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7) 混合溶液，搅拌后，按上述同样操作，合并滤液于减压浓缩器中，40℃以下浓缩 至约30mL。 ②净化方法 在二乙烯基苯－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（60 mg）中，依次注入5mL 甲醇和5mL水，舍弃流出液。柱中注入①提取方法所得的溶液后，注入5mL水，舍 弃流出液。注入5mL甲醇，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去甲醇。 残留物中加入1.0mL乙腈：0.05%三氟乙酸（1：3）混合溶液溶解，此为试验溶液。 2)脂肪 ①提取方法 尽可能除去肌肉层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。加入30 mL正己烷和70 mL 0.2%的偏磷酸溶液，搅拌后，以每分钟3000转离心分离5分钟。收集0.2%偏磷 酸层，用涂布2～3mm 厚硅藻土的滤纸抽滤于磨口减压浓缩器中。取出滤纸上的 残留物，加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，搅拌后，按上述同样 操作，合并滤液于减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约30mL。 ②净化方法 采用1）肌肉的②净化方法。 3)肝脏，肾脏，奶及其它食用部分： ①提取方法 肝脏：搅碎混合均匀后，称取其5.00g，在37 ℃下放置24小时。 肾脏及其它食用部分：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。 奶：称取5.00g样品。 加入100 mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，搅拌后，加入3g硅藻土 混合，用涂布2～3 mm 厚硅藻土的滤纸抽滤于磨口减压浓缩器中。滤纸上的残留 物中加入20mL甲醇：0.2%偏磷酸溶液(3：7)混合溶液，再搅拌后，按上述同样操 作，合并滤液于减压浓缩器中，40℃以下浓缩至约30mL。 ②净化方法 采用1）肌肉的②净化方法。 5．标准曲线的制作 将盐酸吡利霉素一水合物标准品配制成10 mg（以吡利霉素计）/100mL甲醇 溶液，用乙腈：0.05%三氟乙酸混合溶液稀释，配制成在0.05 ～10 mg（以吡利 霉素计）/L范围的溶液数点，分别注入LC/MS，用峰高法或面积法绘制成标准曲 线。 6．定量试验 注入试验溶液于LC/MS中，根据5的标准曲线求出吡利霉素的含量。 7．测定条件 LC/MS 柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径2 ～5 μm），内径2.0～6.0 mm、长100 ～ 250mm不锈钢管。 柱温：40 ℃ 流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:3）混合溶液。 主离子(m/z)： ESI+ 411 保留时间标准：4～6 分钟 8．定量限 0.01 mg/kg。 9．注意事项 1)检测方法概述 肝脏样品，因代謝物吡利霉素亚砜要转变为吡利霉素，所以在37℃放置24 小 时。 本方法用甲醇与0.2%偏磷酸溶液的混合溶液从样品中提取吡利霉素，经二乙烯基 苯－ N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱净化后，LC/MS测定和确证。 2) 注意点 ① 对于LC/MS，标准溶液和试验溶液的标准进样量，内径3.0 mm 柱子为10 μL。因柱子和仪器设备使最佳进样量不同，必须研究最佳的进样量。 ②采用主离子的仪器设备，因为最适合的离子化方法、生成的离子不同，要 研究仪器设备最合适的条件。 对于主离子之外的确证离子，ESI+为363(m/z)。 10．参考文献 无 11．类型 C