核酸的定量分析方法.pptVIP

核酸的定量分析 目录 定磷法 核酸是一类含磷化合物，其分子含有一定比例的磷，一般纯的RNA及其核苷酸含磷质量分数为9.0%；DNA及其核苷酸含磷质量分数为9.2%，即每100g核酸含有9.0～9.2g磷，也就是核酸量是含磷量的11倍左右，故测得磷的量，即可求得核酸量。这就是定磷法的理论依据，磷的定量测定是测定核酸含量常用手段之一。 理论依据 定磷法 含磷有机物 硫酸或过氯酸消化 无机磷 （酸性条件） 钼酸盐 （定磷试剂） 磷钼酸盐络合物 还原剂：黄色物质变为蓝黑色 钼蓝 分光光度计 660nm处有最大光吸收峰 吸收值与磷含量成正比 生物有机磷材料中有时含有无机磷杂质，故用定磷法来测定该有机磷物质的量时，必须分别测定该样品的总磷量，即样品经过消化以后所测得的含磷量，以及该样品的无机磷含量，即样品未经消化直接测得的含磷量。将总磷量减去无机磷才是该有机磷物质的含磷量。 定磷法简单、快速、灵敏度高，但是受蛋白质和核苷酸的影响。 定磷法 紫外吸收法 核苷、核苷酸、核酸的组成成分中都有嘌呤、嘧啶碱基，这些碱基都具有共轭双键 （ -C-C=C-C=C-），在紫外光区的250-280nm处有强烈的光吸收作用，最大吸收值在260nm左右。常利用核酸的紫外吸收性进行核酸的定量测定。 核酸、核苷酸的摩尔消光系数用ε(P)表示，为每升溶液中含有1摩尔原子磷的光吸收值。RNA的ε(P)260nm（pH7.0）为7700～7800，RNA的含磷量约9.5%，因此每毫升溶液含1ug RNA的光吸收值相当于0.022～0.024。小牛胸腺DNA钠盐的ε(P) 260nm（pH7.0）为6600，含磷量为9.2%，因此每毫升溶液含1ug DNA钠盐的光吸收值相当于0.020。 测出260nm处的光吸收值，可计算出核酸的含量。 理论依据 当待测的核酸样品中不含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，既可将样品配制成一定浓度的核酸溶液（20-50ug/ml）,在紫外分光光度计上直接测定。 A260：260nm处吸光度值读数 0.024：每毫升溶液内含一微克RNA的吸光度 0.020：每毫升溶液内含一微克DNA钠盐时的吸光度 L： 比色皿的厚度 紫外吸收法 当待测的核酸样品中含有酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸，在测定时需要加钼酸铵-过氯酸沉淀剂，沉淀除去大分子核酸，测定上清液260nm 处吸光值作为对照。 B：钼酸铵-过氯酸沉淀剂 核酸样品 （酸溶性核苷酸或可透析的低聚多核苷酸） A：蒸馏水 （空白） 混匀 水浴10min 离心10min 取上清液定容稀释 紫外分光光度计上测定 260nm处吸光度 紫外吸收法 紫外吸收法 ——A管稀释液在260nm波长处的吸光度减去B管稀释液在260nm波长处的吸光度 紫外吸收法 紫外吸收法测定核酸含量简便快速，灵敏度高，一般可达3ng/L的检测水平。蛋白质也有紫外吸收，通常蛋白质的吸收高峰在280nm波长处，在260nm处的吸收值仅为核酸的1/10或更低，因此对于含有微量蛋白质的核酸样品，测定误差较小。 优点 缺点 若待测的核酸制品中混有大量的具有紫外吸收的杂质（显著蛋白质、酚、琼脂糖及其他核酸污染物），则测定误差较大，应设法除去。不纯的样品不能用紫外吸收值作定量测定。 荧光分析法 由于 DNA 本身荧光很弱，因此不能利用荧光光度法直接测定 DNA 含量，当某些小分子探针与 DNA 结合后，荧光强度会大大增强，而有一些小分子与 DNA结合后，会引起溶液的荧光猝灭作用。基于这些现象，可用荧光光度法测定 DNA的含量。 荧光分析法 主要是基于嵌入核酸碱基对中，发生共振能量转移导致荧光强度的增强或减弱来进行测定。一些荧光染料体系与DNA结合后,光谱呈现出能量转移特征，引起荧光增强或减弱，即敏化荧光和荧光猝灭现象。能量转移的形式是单重态-单重态转移，由一个发荧光的给体将能量传给一个受体。 1.荧光染料（荧光探针） 吖啶橙(AO)-藏红T(ST)荧光探针测定DNA的研究 吖啶橙(AO)：能量给予体 藏红T(ST)：能量接受体 DNA AO-ST体系能量发生荧光猝灭 DNA浓度与荧光猝灭强度呈线性关系 荧光分析法 检出限 2.6× 10-7mol/L 线性范围为 0～ 1.1× 10-6mol/L 荧光分析法 1.DNA促进AO-ST间的荧光能量转移 下图表明ST的电子吸收光谱与AO的荧光发射光谱重叠。AO的荧光在ST存在时明显地被淬灭，说明两者在水溶液中存在能量的转移，在体系中AO作为荧光能量的给予体，而ST则是能量的接受体。当有DNA存在时，AO-D