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细胞生长曲线绘制实验报告 　　MTT法测定细胞生长曲线　　1、取生长状况良好的细胞，常规消化制成单细胞悬液并计数，调整细胞成六个浓度梯度，依次为：5x10、1x10、2x10、3x10、4x10、5x10/ml，均匀接种细胞于96孔细胞培养板，每孔加细胞悬。　　液200ul，每个浓度组设6个复孔,共接种7块培养板，37℃、5%C02浓度，饱和湿度培养箱中连续孵育24/48/72/96/120/148/172小时后。　　2、每孔加入20ulMTT溶液(smg/m1用PBS配)，继续孵育4h后终止培养。　　3、快速翻转培养板,弃去上清液,每孔加入150ulDMSO,振荡10min，使MTT蓝紫色结晶完全溶解。　　4、用酶联免疫检测仪于490nm处检测各孔的吸光值(OD值)，并以未接种细胞只加培养基孔的吸光值为空白对照调零，取6孔平均值。　　5、实验重复3次，以培养“时间”为横轴，“吸光值”为纵轴绘制细胞生长曲线。　　细胞生长曲线的测定　　1．取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，用新培养基制成细胞悬液后计数(见　　四、细胞传代培养的实验步骤)。如是非粘壁细胞，则离心弃旧培养基后，换上一定量的新鲜培养基然后制成细胞悬液计数。　　2．根据细胞计数结果按每个小方瓶5×104／mL作传代培养接种细胞，共接种21瓶细胞。　　3．24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数。计算平均值。连续计数7d。　　4．根据细胞计数结果，以单位细胞数(细胞数／mL)为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线。(细胞计数方法请参照实验三)　　(二)细胞生长曲线测定(MTT法)1．制备1mL细胞悬液。空白对照以1mL培养基代替细胞悬液。加入0．1mLMTT于37℃孵育4h。使MTT还原为蓝紫色甲月赞结晶。　　2．加1mLDTW脱色液，37℃至少静置30min(甚至过液)，使甲质颗粒充分溶解。　　3．吸取200μL该溶解液至96孔板孔中，在酶标仪上读取OD值，检测波长570nm，参考波长630nm。　　4．每隔24h测量一个点，每个点为3个平行样品的平均值。　　细胞蛋白电泳　　一.细胞总蛋白抽提细胞裂解液　　三去污裂解液:50mmol/LTris-cl(pH)，150mmol/LNaCl，g/L叠氮钠，1g/LSDS，100mg/LAprotin，10g/LNP-40，5g/L去氧胆酸钠，100mg/L苯甲基磺酰氟(PMSF)　　　　总蛋白抽提程序：　　洗细胞3次　　2.加入裂解缓冲液，冰上放置20min　　3.收集裂解液　　4.离心，1XX转，2~10min　　5.吸取上清，蛋白定量，分装，保存在-78度备用。　　试剂：　　1.30%聚丙烯酰胺：29g丙烯酰胺，1gN,N-亚甲双丙烯酰胺，100ml水，滤膜过滤，棕色瓶，室温保存　　2.10%过硫酸铵：1g过硫酸铵，10ml水，4℃保存　　3.10%SDS：100gSDS，1000ml水，68℃助溶，pH　　4.TEMED：lmlTEMED，99ml水，棕色瓶，4℃保存　　5.5XTirs-甘氨酸电泳缓冲液：Tirs碱，94g甘氨酸，50ml1(来自:写论文网:细胞生长曲线绘制实验报告)0%SDS，1000ml水，使用时配制成1X　　【操作步骤】　　l.将电泳槽玻璃板洗净，吹干，安装好；　　2.用1％的琼脂糖电泳缓冲液封严玻璃板的边和底；　　3.配分离胶，将配好的分离胶立即倒入凝胶槽内，至凝胶槽高三分之二处，加入蒸馏水密封。待胶凝固后，约需30min，倒掉水，用吸水纸吸干；　　4.配浓缩胶，将配好的浓缩胶立即倒入凝胶槽内，插入梳子；　　5.待胶凝固后，拔出梳子，加入电泳缓冲液：　　6.样品处理：取标准蛋白或样品20μl，加入20μl样品缓冲液，混匀，100℃水浴加热3~5min，然后加入10μl溴酚兰溶液，混匀；　　7.加样：将处理好的样品10μl加入到凝胶孔中，连接电泳仪；　　8.电泳：打开电源，调整电压至100V，开始电泳，待样品全部进入凝胶后，将电压调至120V，待指示剂到达凝胶的底部距离下缘1cm时停止电泳，取下玻璃板，小心地把其中一块玻璃板从凝胶上取下来，测量分离胶的长度及分离胶上沿至溴酚蓝带中心的距离，取出分离胶　　一、实验方案设计　　二、实验报告　　三.实验总结