抗生长抑素抗体ELISA检测法的建立及应用研究-动物遗传育种与繁殖专业毕业论文.docxVIP

抗生长抑素抗体的ELISA检测法的建立及应用研究武睿摘要 抗生长抑素抗体的ELISA检测法的建立及应用研究武睿 摘要 生长抑素(SS)足下丘脑核团分泌的神经调节肽，与生长激素释放激素(GHRH) 一起，分别起到抑制和促进生长激素(GH)分泌的作用，参与生长激素和生长的调 节，是生长发育调节的重要激素。应用ss主动或被动免疫及基因免疫动物，可使体 液中ss水平下降、促进GH的分泌，从而达到促进动物生长的目的。而建立操作简 便、准确可靠的ss及其抗体检测方法，对检测基因疫苗的有效性及其作用机理研究 具有重要的意义。为了建立抗ss抗体的ELISA(酶联免疫分析法)检测方法，以 用于本室SS基因疫苗作用检测及其机制研究，本研究应用生物信息技术原理，通过 分析ss和辣根过氧化物酶(HRP)的一级、二级和三级结构和多种理化性质，推测 出二者的最佳偶联部位。然后，应用化学偶联法合成SS．HRP酶标记物，并对其进 行多项质量监测。最后，建立检测抗ss抗体的直接ELISA检测方法，并用于实际 的SS基因免疫小鼠血中抗ss抗体水平的检测。 一、 对ss和HRP的分子结构和理化性质分析 应用生物信息学原理，分析SS和HRP的一级结构、二级结构和三级结构信息 资料，包括分子表面、静分子电场、理化性质分析(如亲／疏水性、等电点、抗原性、 可溶性等)。结果表明，SS的三级空间构型可以使其氨基酸侧链的可偶联基团得以 充分展开，HRP的三级结构可以在一定程度上(50％)使其氨基酸侧链的可偶联基 团外露，二者均适宜用于化学偶联反应。并且，为下一步进行SS与HRP相应基团 的化学偶联提供了可偶联基团的数目与比例(SS，4，28．54％；HRP，37，11．9％)、 可偶联部位、适宜的偶联缓冲体系等理论依据。 二、 两种化学偶联法制备酶标记物(SS．HRP)及其质量比较 应用两种化学偶联法一EDC法和高碘酸钠法，分别制得SS．HRP偶联物，并 对其进行了紫外一可见光分光光度计扫描检测。依据扫描结果，对HRP的质量、偶 联物的光吸收性质，吸收峰值进一步分析。分析结果表明，偶联产物较其偶联前， 各波长下的吸光值和特征吸收峰位置及高度发生了明显变化(从278．180 Ilm变到 250-300 nill，从403 nnl变到402 rim)。并且发现，由高碘酸钠法得到的偶联产物中 的HRP的浓度、HRP标记率和HRP--SS摩尔比(分别为0．809 mg／ml，115．3％和1： 30)，略高于EDC法得到的结果(分别为0．534mg／ml，74．8％和1：23)。 三、 ELISA方法的建立、优化和有效性验证 用分别含有上述两种方法制得的SS．HRP偶联产物进行ELISA方法的建立、优 化，并分别对其ELISA方法的可重复性、有效性、灵敏性、剂量一吸光度依赖性曲 线(即标准曲线)、最小检出限作出鉴定。鉴定结果表明，用EDC法偶联所得产物 较高碘酸钠法在所构建的相应ELlSA方法的结果可重复性、灵敏性、剂量一吸光度 华中农业大学2006届硕士学位论文线性范围(EDC法偶联物，25．400 华中农业大学2006届硕士学位论文 线性范围(EDC法偶联物，25．400 n目高碘酸钠法偶联物，50-400 ng)和最小检出 限(EDC法偶联物，25 ng；高碘酸钠法偶联物，50 rig)等方面占有优势。 关键词：生长抑素化学偶联EDC法商碘酸钠法ELISA Ⅱ 抗生长抑素抗体的ELISA检测法的建立及应用研究武睿ABSTRACT 抗生长抑素抗体的ELISA检测法的建立及应用研究武睿 ABSTRACT Somatostatin(SS)is one of the most important neuropeptides secreted from hypothalamus nuclei，conbining with GHRH(growth hormone-releasing hormone)， exerting art inhibitory and stimulatory influcnces，respectively,on pituitary somatostrope cell，which is a kind of GH(growth hormone)secreting cells．Through a method of SS positive，negtive or gene immunization，the spontaneous SS levels in mamals will be decreased and consequently the GH be increased．And then，the growth of animals can be promoted．It