植物病理学研究方法第6章第2节.pptVIP

植物病理学基础研究方法 （第6章第2节) 分子生物学技术在植物病原物鉴定、检测中的应用 第二节 分子生物学技术在植物病 原物鉴定、检测中的应用 分子生物学技术已经应用于一切生物学领域。在植物病理学研究中已应用于植物病原物的鉴定、检测，抗病基因的克隆以及抗病转基因植物的培育中。 本节中主要学习应用PCR及相关技术进行植物病原物的鉴定、检测等问题。 第二节 分子生物学技术在植物病 原物鉴定、检测中的应用 一. PCR（聚合酶链反应）技术 （一）PCR的原理 （二）PCR技术的操作 （三）PCR技术的发展 （四）PCR技术在植物病理学中的应用 二. RAPD方法 与 SCAR标记 三. RFLP 和 AFLP技术 四. 核酸序列分析 一 .PCR（聚合酶链反应）技术 PCR（polymerase chain reaction）技术，即“聚合酶链反应”，是体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，由美国科学家Mullis于1983～1985年发明。 该技术模拟发生于生物细胞内的DNA复制过程，无需繁琐的基因克隆程序便可在数小时内获得大量拷贝的特异DNA片段，其步骤简便，结果可靠，为研究和分析基因提供了一种全新的方法，被誉为分子生物学技术上的一场革命，在生物学各个领域都得到广泛的应用。 Mullis荣获1993年度诺贝尔化学奖。 （一）PCR的原理 PCR的原理与体内DNA复制的过程相似，它模拟DNA聚合酶在生物体内的催化作用，在体外进行特异DNA序列的聚合和扩增。 DNA的结构:4种脱氧核苷酸组成 DNA复制的酶学 底物:dNTP 即dTTP dATP dCTP dGTP 酶:DNA聚合酶(polymerase), 拓扑异构酶,解螺旋酶,引物酶, DNA连接酶(ligase)。 模板(template):解开成单链的DNA母链 引物(primer): 提供3‵-OH使dNTP依次聚合。 蛋白因子：单链结合蛋白(SSB)。 DNA复制的起始就是要解开双链和生成 引物。 (一)DNA解成单链 由拓扑异构酶松弛超螺旋，解螺旋酶 解开双链，SSB结合到单链上使其稳定。 (二)引物合成引发体引导引物酶到达适当的位置合成引物。引物长度约为十几个到几十个核 苷酸不等。引物的合成方向也是5′→3′方向。 (三)延伸(elongation)： 复制体延DNA移动， dNTP依次聚合。 PCR的3个基本反应 ＰＣＲ即是在体外模拟ＤＮＡ复制的过程，它用加热的办法让所研究的ＤＮＡ片段变性变成两条单链，人工合成两个引物让它们结合到ＤＮＡ模板的两端，ＤＮＡ聚合酶即可以大量复制该模板。 PCR是由3个基本反应: 变性、退火、延伸 3步反应周期反复循环。 每循环一次所产生的DNA均能成为下一次循环的模板。 20次PCR循环将产生约一百万倍(220)的扩增产物。 变性（双链DNA解链成单链） 1.变性： 将反应体系 置高温下 (91～94℃,1min), DNA双螺旋的氢键断裂(变性)，形成单链DNA。 退火（按碱基配对原则结合形成双链区） 2.退火： 使温度下降 (37～65℃,1min)， PCR反应体系中的引物与模板链3’端互补区退火（按碱基配对原则结合形成局部双链区），引物与模板结合。 延伸（ DNA合成链的延伸） 3.延伸；72℃，2min, 在适当的缓冲液中， Mg2+存在条件下， Taq DNA聚合酶按模板的碱基顺序不断引入4种dNTP（脱氧核苷三磷酸）合成互补链，按5′→3′的方向不断延伸。 由于两引物都是按与扩增区段两端序列彼此互补的原则设计的，在每一条新合成的DNA链上都具有新的引物结合位点。 从退火到延伸 PCR扩增过程 （二）PCR技术的操作 冰上向管中依次加入下列试剂： 总体积 25μl 10×Buffer 2.5μl MgCl2 2 mmol/L dNTP 0.2mol/L（4种dNTP各1/4） 引物 0.2μmol/L 模板 10ng Taq酶 2μL 双蒸水 补至终体积 微量移液器的使用方法 反应循环参数 反应管放入PCR仪中， 按如下程序操作： 94℃预变性 2～ 5min 94℃变性 1 min 45～62℃退火 1 min