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第十章 目的基因的分离 吴 乃 虎 中国科学院遗传与发育生物学研究所 第十章 目的基因的分离 一、引言 基因分离技术发展简介 基因分离技术迅猛发展的客观要求 目的基因的分离 二、分离克隆基因的若干主要方法 应用核酸探针分离克隆的目的基因 应用差别杂交法或扣除杂交法分离克隆的目的基因 低丰度mRNA之cDNA末端的快速扩增RACE法 根据蛋白质家族的保守序列鉴定新的相关基因 通过表达载体分离特异的cDNA 三、应用mRNA差别显示技术分离目的基因 引言 mRNA差别显示原理 mRNA差别显示实验过程及其局限性 四、DNA标签法分离目的基因 原理 转位子标签法 T-DNA标签法 五、酵终双杂交与单杂交体系 酵母双杂交体系 酵母单杂交体系 酵母三杂交体系 第十章 目的基因的分离 一、引言 1．基因分离技术发展简介 *1.在上个世纪70年代中期已经具备了分离基因的能力 这主要是取决于当时重组DNA技术的发展水平，特别是发展出了安全的寄主菌株和克隆载体： 第一个安全的大肠杆菌寄主菌株——X1776品系的诞生 第一批安全适用的克隆载体pM19和pBR322的问世 在上述这两个条件的基础上，分子生物学家成功地克隆出第一批基因。 *2.在上个世纪70年代末期克隆基因分离的能力明显提高 这主要应归功于基因克隆策略的改变。由于发展出了改良的寄主菌株和克隆载体，人们提出了先克隆cDNA再分离目的基因的新策略。 *3.在上世纪80年代克隆基因分离技术得到了进一步的提高 20世纪80年代之后，由于如下技术的进步，使人们分离克隆基因的能力得到进一步提高，这些技术主要有如下几项： 寡核苷酸合成技术的改良； 操作RNA和DNA的酶学方法的进步； PCR技术的发展与应用； *4.目前科学家们已经掌握了先进的分离克隆基因的能力 就目前的能力而言，可以说几乎任何期望克隆和分离的目的基因都是有可能被分离出来的。其主要原因是： 技术的进一步发展； 基因组全测序工作的迅速进展与成功； 未知产物的发育调节基因分离技术的发明， 例如mRNA差别显示技术 基因定位克隆技术 DNA标签技术等 2．基因分离技术迅猛发展的客观要求 近年来基因分离技术的迅猛发展，特别是产物未知的发育调节基因分离技术的发展尤为迅速，已发展出了基因定位克隆技术、mRNA差别显示技术、DNA标签法分离目的基因的技术(包括T-DNA标签法和转座子标签法)、以及酵母双杂交和单杂交技术。有关这些技术我们在下面章节中，都将作详细的叙述。归纳起来，近年来基因分离技术迅速发展的主要原因有如下三点： A.人类基因组计划 人类基因组的复杂性：MW=2.9×109bp，约有6×109核苷酸对和近100000个基因。经过千百万年的分化和繁衍，今天全世界有50多亿人口，因此人类基因之正常与异常的突变形式更是千百倍于基因的基本数目。 1988年9月，美国最负盛名的分子生物学家，DNA双螺旋结构的发现者之一Watson在众望所归之下，接受美国卫生研究院的邀请出任“人类基因组解读计划”的负责人，开始了令全世界科技界瞩目的“基因圣战”。——这是场追猎人类致病基因的圣战。 1992年4月10日下午1时，Watson在冷泉港实验室内将辞呈传真到华府卫生研究院给顶头上司Bernadine Healy，希利在接到辞呈后不说一句慰留的话，立即批准。 Watson辞职的原由分析：他们两人的冲突始于基因专利事件。 Watson：是一位才华横溢的诺贝尔奖得主，在学术界极负众望。 Healy：是一位哈佛医学院出身，从事科学行政工作多年，是美国生物医学界权倾一时的官员。 Watson是一位典型的传统科学家，他主张科研应以增进人类福利为目的，因此科研成果应该与世人共享，不得私藏。面对当前的基因研究狂潮，他最担心的是会引发一阵淘金热，妨碍科学合作。 Hearly观点恰恰相反，她最感兴趣的是如何将科学成果转换成技术及经济实力。在未征询Watson意见的情况下，径自提出有关基因专利的建议。 *专利事件引发了国际压力、预算争夺战、NIH内部政治生态复杂化，使Watson觉得不堪负荷。于是提前一年拂袖而去，回归研究天堂——冷泉港实验室。 专利事件没有因人事更迭而顺利解决，研究所夹带的汹涌暗潮正一波又一波地展现出它的威力，基因研究已深深地介入人类社会的个个角落。人类基因组计划专利事件深深地激发人们去发展特异基因的克隆分离技术，成为基因克隆分离技术发展的强大动力。 B.基因分离与农业育种 全世界范围内的人口膨胀对粮食需求的增加，要求应用基因工程技术培育高产、抗病、抗逆的农作物新品种。 农作物遗传转化技术的建立为基因工程在农业中的应用奠定了良好的基础。在80年代末90年代初期，随着植物基因工程研究的不断深入，绝大多数具有重要经济意义的农作物品种的遗传转化方法都