细胞信号转导研究方法.ppt

SDS电泳 转膜（PVDF或硝酸纤维素膜） 封闭 一抗 洗涤 标记二抗 洗涤 显色或化学发光显影 免疫荧光技术Immunofluorescence (IF) 利用某些荧光素，如FITC等通过化学反应与抗体或其它蛋白结合制备成荧光探针，然后与被测抗原或配体发生特异性结合，形成的荧光复合物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此利用荧光显微镜可对抗原进行定性或定位检测。 采用流式细胞免疫荧光技术（FCM）可从单细胞水平检测不同细胞亚群中的蛋白质分子，用两种不同的荧光素分别标记抗不同蛋白质分子的抗体，可在同一细胞内同时检测两种不同的分子（Double IF），也可用多参数流式细胞术对胞内多种分子进行检测。 免疫共沉淀（Co-IP） GST融合蛋白进行Pulldown实验 酵母双杂交系统 将编码某一蛋白X的DNA序列与DNA结合域BD的编码序列融合形成一个杂交体(“诱饵”bait)，将编码另一蛋白Y的DNA序列与DNA激活域AD的编码序列融合形成另一个杂交体(“猎物”或靶蛋白prey or target protein)，当两个杂交体共转化酵母细胞（此酵母细胞含有上游有DNA结合位点的报告基因），若X和Y没有相互作用，则单独不能激活报告基因的转录；若X和Y可相互作用，则使BD和AD靠近形成一个有效的转录激活子，激活报告基因的转录。因此可通过检测报告基因的转录来研究蛋白质X和Y的相互作用。 1）已知蛋白之间相互作用的检测 2）蛋白质的功能域研究：通过对其中某一个蛋白质作缺失或定点突变，再用此系统检测是否还存在相互作用，可阐明其功能域或关键氨基酸 3）克隆新基因和新蛋白：将感兴趣的蛋白质基因与BD基因构建成“诱饵”表达质粒，将某一器官或组织的cDNA文库与AD基因构建成“猎物”基因库，共转化酵母细胞，可筛到与感兴趣蛋白质相互作用的蛋白质的cDNA序列，并推测其蛋白质序列 * * * * 信号转导途径研究方法 1. 蛋白质表达水平和细胞内定位研究 信号蛋白分子表达水平及分子量检测: Western blot analysis. 信号蛋白分子在细胞内定位研究: Immunohistochemistry / Immunocytochemistry Immunofluorescence (IF) Green fluorescent protein (GFP and its derivatives)-fusion protein—typically, live cells. 硝酸纤维素膜 目的蛋白质 抗目的蛋白一抗 标记的二抗 偶联的碱性磷酸酶 磷酸化生色体系 脱磷酸显色 采用Western blot方法检测蛋白质原理示意图 Fig. Activation of PPAR mediates curcumin suppression of the gene expression of EGFR in Moser cells. To study the effect of curcumin on the expression of EGFR and to elucidate the underlying mechanism, preconfluent Moser cells were pretreated with or without PD-68235 (10 μM) for 30 min before addition of curcumin at indicated concentrations for an additional 8 h. Whole cell protein extracts were prepared for Western blot analyses. β-Actin was used as an internal control for equal protein loading. 2. 蛋白质与蛋白质相互作用的研究技术: Co-IP（免疫共沉淀） with antibody against one protein followed by Western blot with antibody against another protein GST pull-down assay Yeast or mammalian two-hybrid assay FRET (fluorescence resonance energy transfer) assay Double IF—to assess co-localization of different pro