狂犬病的试验室检测与诊断技术课件.ppt

狂犬病的潜伏期到底能有多长？PCR技术应用于狂犬病毒来源鉴定的一个精彩例证： 美国CDC的Smith等对从美国3名狂犬病死者分离的毒株的鉴定。死者均为移民，其一移民时间已达6年。 由于在美国感染狂犬病的机会极少，而且PCR／序列分析的结果直接证明分离株分别与死者来源国家的狗中流行的毒株相同，所以该作者以迄今最令人信服的方式证明了狂犬病的潜伏期可长达6年以上。 3. 狂犬病毒G基因的序列测定和系统树进化分析 1981年Anilionist等报道了狂犬病毒G基因序列，随后几年里，又对几株狂犬病毒部分的或全部的基因进行测定。由此，通过序列分析，对各毒株之间的相互关系有了进一步了解，明确了狂犬病毒分类的分子基础。 逐渐将狂犬病毒的核酸、氨基酸序列与已知的生物学和免疫学的特性联系起来。可以推测或确定病毒的抗原决定簇，和病毒致病力有关的分子基础，以及病毒感染、复制和变异等的重要功能性氨基酸区域。 这对研制狂犬病毒新型疫苗和抑制狂犬病毒感染和复制有着重要的指导作用，从而更有利于对狂犬病毒的预防和和亚洲不同地区、不同来源的RV街毒株的Ｇ基因的全序列，确定决定其毒力、免疫原性和致病性的主要功能区，进行了序列的系统进化比较分析，探讨我国及周连地区RV的遗传变异规律。 我所与法国巴斯德研究所一项合作研究的实例： (1) RT-PCR及测序引物 参考文献和PV株序列，并用Oligo4.0软件进行校验，最后选取的引物为： N（55-73） 5’ ATG-TAA-CAC-CTC-TAC-AAT-GG 3’ PA(3000-3019) 5’ TGG-TGT-ATC-AAC-ATG-RAY-TC 3’ PB(4077-4096) 5’ ACC-CAT-GTY-CCR-TCC-ATA-AG 3’ PC(3894-3913) 5’ GAT-TAC-ACY-ATY-TGG-ATG-CC 3’ PD(5516-5536) 5’ GAG-TTN-AGR-TTG-TAR-TCA-GAG 3’ P1 5’ CTC-ATG-TGA-ACG-GGG-TGT 3’ (2) 病毒RNA的提取及RT-PCR 于四日龄乳鼠脑内接种狂犬病病毒，注射量为0.02ml/只。待小鼠出现明显症状时，取脑进行荧光抗体检测（IFA）。 对阳性鼠脑，采用TRIzol? Reagent (GIBCOBRL)提取总RNA。用N与PC为引物，采用AMV Reverse Transcriptase (Promega)逆转录合成cDNA。 在0.5 ml Ep管中依次加入35.5 μl灭菌水、1μl dNTP、5 μl 10×Buffer、3 μl MgCl2 、1 μl PA(1ul PC)、1 μl PB(1ul PD)、1 μl cDNA，短暂离心后100℃水浴1 min，再加入0.5 μl DNA聚合酶，50 μl液体石蜡，短暂离心后置于PCR仪：经94℃ 1min，58℃ 50 s，72℃ 90 s共循环40次，72℃保温10 min后冷却至4℃。10000 r/min离心5 min后取下层水相转入1.5 ml Ep管，取5 μl用于电泳鉴定，余下的-20℃保存用于纯化。 (3) 产物纯化 采用Wizaed? PCR Preps DNA Purification System (Promega)纯化PCR产物。 (4)电泳鉴定、cDNA序列测定 取5 μl未纯化产物或1 μl纯化产物进行1.2%琼脂糖电泳。测序由大连宝生物有限公司完成。 (5) 序列分析 序列的比较排序采用CLUSTER以及GENEDOC软件处理。 聚类分析(进化系统树的构建) 2) 结果和讨论： 用计算机分析四株病毒糖蛋白基因（G基因）开放读码框架（ORF），四株病毒G基因编码区均从起始密码ATG开始，除终止密码广西-4株为TAA外均为TGA，从ATG到终止密码全长共1575个核苷酸残基。 (1) 与其它狂犬病毒GP基因核苷酸序列同源性的比较 (2) 狂犬病毒G基因不同区段比较 (3) 疫苗的评价 (4) 聚类分析(进化系统树的构建) 五、 狂犬病毒抗体的检测 WHO狂犬病专家委员会认为大