聚合酶链式反应.ppt

ppt课件 聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction-PCR 检验科PCR室 * ppt课件 1984年，Kary.B.Mullis教授发明了具有划时代意义的PCR技术。1985年，实验室技术成熟并逐步在临床上应用。并因此项技术于1993年获得诺贝尔化学奖。 二十世纪九十年代开始，在国内各级医院广泛开展。 2000年左右，全国开始规范化管理，工作人员需要培训资质，实验室需经过相关机构认证。 * ppt课件 为什么要引入PCR? 1、病原体检测结果出具时间与临床诊疗相脱节。 2、特殊病原体检测，所需时间过长。 3、部分病原目前尚无体外培养检测方法。 4、方法学上，简便性、灵敏度及特异性要求。 5、疗效评估及停药点确定。 6、疾病研究步入分子水平，对检测方法的要求。 * ppt课件 PCR指的是在体外，以某一保守区段为模板，以一对特异性引物进行诱导，以游离的碱基为原料，在Taq酶的催化下，对目的基因迅速扩增，产物呈指数增长的一种分子生物学技术。 什么是PCR? 四要素：模板 引物 聚合酶 核苷酸 四特点：高灵敏度 高特异性 快速 体外 * ppt课件 DNA在细胞内是如何复制的？ * ppt课件 PCR的原理是什么（定性）？ 变性：使双链DNA变为单链。 95 ℃ 退火：使引物和互补模板结合 。 55 ℃ 延伸：按5′→3′方向以引物为起始点复制 72 ℃ * ppt课件 PCR技术如何实现载量分析（荧光定量）？ 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓度进行定量分析。 * ppt课件 reverse primer R Q forward primer 3 3 5 5 3 5 5 1. Polymerisation probe R Q 3 3 5 5 3 5 5 2. Strand displacement Q 3 3 5 5 3 5 5 3. Cleavage R 3 5 5 3 5 5 4. Polymerisation completed Q R 3 每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比 * ppt课件 目前应用的PCR技术有哪几类？ 1、普通PCR检测技术（定性） 2、实时荧光定量PCR检测技术（外标法） 3、高敏感度荧光定量PCR检测技术（内标法） * ppt课件 如何进行结果报告（定性PCR）？ 荧光染料染色：溴化乙锭（EB） 琼脂糖凝胶制作 加样 电泳 * ppt课件 M：DNA ladder；A：阳性对照；B：阴性对照 C、D：待测标本 结果判断：阳性对照为阳性、阴性对照为阴性、条带大小与Marker一致。 * ppt课件 PCR扩增曲线线性图 基线期 指数增长期 线性增长期 平台期 阈值线 CT值 如何进行结果报告（定量PCR）？ * ppt课件 基线 基线（Baseline）：扩增曲线中的水平部分。 设置原则： 起点一般取3~6，终点一般取12~15。 * ppt课件 阈值线 阈值线（Threshhold）：荧光扩增曲线上人为设定的一个值。依据此线判断指数增长期。 设置原则：要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段。 设置方法：缺省设置是 3-15 个循环的荧光信号的标准偏差的 10 倍。 * ppt课件 Ct值 Ct（Cycle Threshhold）值：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数被称为 Ct 值，是实时荧光定量PCR判断阴、阳性和进行定量分析的依据。 CT值 * ppt课件 PCR扩增标准曲线线性图 由右到左浓度分别为：104、105、106、107 * ppt课件 标准曲线分析 斜率、截距、相关性 * ppt课件 Slope（斜率）：理论要求3.33±0.5。 Intercept（截距）：理论要求40±4，不同公司的试剂截距有很大的不同，主要是指只有1个病毒扩增时，曲线出现的Ct值。 R2（线性相关性）：理论要求大于0.99 注：优质试剂的标准品每次实验的参数是比较稳定的，做质控分析后偏差应在±2SD范围内，Ct值变异系数应小于10%。 标准曲线分析（Standard Curve） * ppt课件 整体曲线的观察：分析是否有因物理或其他因素造成的异常曲线情况； 阴性对照分析：观察是否存在污染； 阳性对照分析：观察是否在质控范围内。 标准品分析：观察标准品分布是否均匀分布，斜率、截距及相关系数是否理想； 定量结果的分析方法 * ppt课件 * ppt课件 * ppt课件