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IGEM PKU Count Group 分子实验基本操作培训 余涛，郑勤思 2008-4-13 Outline 分子实验基本流程介绍 分子实验基本操作的原理、步骤及注意事项 总结 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收（电泳） 连接 小提质粒并酶切鉴定（电泳） 大肠杆菌的培养 转化 分子实验基本流程介绍 感受态的制备 PCR克隆目的片断 酶切及酶切片断回收（电泳） 转化 连接 小提质粒并酶切鉴定（电泳） 大肠杆菌的培养 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 原理 大肠杆菌在37 ℃下在较好较快的进行增殖， 4 ℃下则可较好停止代谢，便于保存。（长期保存应在-80 ℃ 用15-20%甘油冻存） 由于转入的质粒带有抗性标记，用带有抗生素的培养基即可进行选择性培养。 分为固体培养基培养和液体培养基培养 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 Step0: LB培养基的配制(1L培养基含) 10g Tryptone 5g Yeast Extract 10g NaCl 15g Agar (仅在固体培养基中加入，注意琼脂为Agar琼脂糖/Agarose区分) 1L 去离子水 一般一瓶配100-300mL Step0’: 灭菌（此后一切保持无菌操作） 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 （用于筛选或短期保存菌种） Step1: 倒板 微波炉加热培养基 - 室温冷却至60 ℃左右 - 移入超净台，加入抗生素（1000*的，即需稀释1000倍），摇匀 - 趁热快速倒入平板，12mL/板 - 超净台内室温冷却凝固 Step2: 接种 划线法：烧红接种环 - 冷却 - 蘸上菌液 - 在平板上划线 -灼烧接种环。 多用于菌种保存 平铺法：用玻璃刮刀将菌液铺干与平板上，多用于转化 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 固体培养基培养 Step3：37℃培养箱中培养。注意需要先正置10min（防菌液倒流）再倒置培养（防止染杂菌）。注意培养时间不可过长，一般不超过16小时，防止突变株产生。 Step4：培养结束后，需放入4 ℃冰箱的，为防止染杂菌，最好用parafilm封口。 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 液体培养基培养（用于扩增） Step1：取出适量培养液于锥形瓶或试管。 Step2: 加入适量抗生素。 Step3：将目标菌落挑入培养液。（可用接种环或枪头） Step4: 将培养液放入37 ℃摇床中培养，转速一般为220rpm。（为什么要摇？） 分子实验基本操作——大肠杆菌的培养 注意事项： 无菌操作！！！ 抗生素加入的时机及量 培养时间（不可过长） 返回 分子实验基本操作——感受态的制备 原理： 感受态 - 可接受外来DNA的状态 CaCl2法制备 – Ca2+可以使膜骨架发生改变，产生膜 上的小孔洞，并可使DNA分子结合并进入细胞内。 步骤：比较麻烦，属较考验分子操作的实验之一。往往大批量制备，因此不需经常进行。 注意事项：感受态制备后应立即冻存于-80℃。使用时不可反复冻融。 返回 分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 原理： 限制性内切酶： 1）发现于细菌中，用于降解噬菌体的DNA；宿主自身的DNA则被甲基化。 2）分为I、II、III类。常用II类（识别位点与酶切位点一致） 3）区别与外切酶活性（内切酶彻底切断DNA双链，外切酶只切其中一链，往往用于DNA复制的实时检验。） 分类：单切和双切 分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 单切： Step1: 酶切体系的选定 确定选用的酶 - 查找对应高效率的buffer（常用的buffer有H, M, L, K, T 五种），确定要不要加BSA H, M, L, K, T buffer 都有什么？ H-High, M-Medium, L-Low, K-KCl, T-Tri-Acetate B-L, G-M, O-H, R-K, Tango-T 分子实验基本操作——酶切及酶切片断回收 Step2: 配制酶切体系： 以10uL体系为例 0.5uL 内切酶（含50%甘油防冻） 1uL Buffer (10*) 5uL 质粒 3.5uL 去离子水 原则： 1） 甘油含量不可超过总体系5%，防止星火性 2） 质粒可根据具体情况调整 3） 内切酶切记不可