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糖化酶的生产流程设计方案 　糖化酶即葡萄糖淀粉酶(1 ,4 - α- 葡聚糖葡聚糖水解酶, EC. 3. 2. 1. 3) ,是淀粉糖化工艺的主要酶类,被广泛地应用于 食品、医药、发酵等工业。目前,糖化酶的生产菌种主要为 黑曲霉。根据使用的生产菌种不同及发酵工艺不同,工业 生产中,糖化酶的发酵生产水平在35 000～55 000UPmL 不等。 糖化酶的工业化生产从过去的固体发酵沿革到上世纪90 年 代初,液体发酵工艺逐步取代了原固体发酵工艺。液体发酵 工艺的建立与应用极大地改善了发酵产品质量并大幅度提升 了糖化酶的发酵生产水平。但现有糖化酶发酵生产技术共同 存在不足之处,其中种子制备周期和发酵生产周期很长是一 个较突出的问题,如实验室的种子制备需要15d 以上,发酵周 期通常200h 以上。 生产流程图 试验菌种的分纯 培养基 固体培养基，察氏培养基+1％酵母膏+1％蛋白胨；（2）初筛培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=7:3:2:0.16 （3）诱变后培养基，玉米粉：麸皮：米糠：硫酸胺=8：3:1.5:2:0.16，水80ml。 原料：玉米粉、麸皮等 （3）菌种分纯 将麸皮采集菌种取出一部分，置入装有10mL生理盐水和若干玻璃珠的小三角瓶内，振荡15分钟，将上清液一次稀释成10-1、10-2、10-3，各取0.1mL做平板划线，29℃培养5~6天，分别挑取单个菌落接入斜面，29℃培养一周。 以大连某厂的生产用菌B-11为对照，对分离菌株做摇床发酵试验，96h后测定糖化力，配合镜检，确定诱变的出发菌株。 二、试验菌株的诱变 用生理盐水洗下成熟出发株的孢子、倒入5mL麦汁种1％酵母膏的三角瓶中，振荡1.5h，使孢子活化，后3500r/min.离心分离15分钟，用pH7.2磷酸缓冲液洗涤一次，再用缓冲液5ML洗转入小三角瓶内（内有数枚无菌玻璃珠），振荡10分钟，使孢子分散均匀，过滤，制成单孢子悬浮液，将浓度调至106个/ml 取10ml孢子悬浮液于9cm平板中，紫外线（UV）照射诱变2分钟（避光操作），紫外线动率15W，室温，搅拌，照射距离30cm。 向经紫外线处理的菌液中加入硫酸二乙酯（DES）稀液（原液1ml，95％乙醇4ml配制）0.1ml，32℃恒温处理15分钟，不断摇动平皿，处理后立即稀释至10-2、10-3（中止反应），各取0.1~0.2ml涂平板，29℃培养5天后挑取单菌接入试管。 摇床发酵试验，优选出糖化力高的新菌株UD-7等。 三、糖化酶的制备 (一)材料：菌种：黑曲霉 仪器：恒温培养箱离心机水浴锅恒温液体振荡 培养器小型液体发酵罐分光光度计等 试剂：链霉素0．1％苯甲酸钠乳酸氢氧化钠硫酸 铵等 （二）设备 LRH-250 型生化培养箱 上海一恒科技有限公司； TGL-16C 型台式高速离心机 上海安亭科学仪器厂； 1086型精密水浴锅 德国GFL公司；HYG-II型迴转式恒 温调速摇瓶机 上海新星自动化控制设备成套厂；UV- 2100 型紫外分光光度计 UNICO(上海)仪器公司；LS- 350L 型立式压力蒸气灭菌锅 上海医用核子仪器厂； MP2000D 型电子天平 精科仪器(上海)有限公司；DG- 2B 多功能恒温箱 上海医疗器械修造厂；超净工作台 苏净集团安泰公司。 (三)方法 液体深层发酵 工艺流程：试管斜面菌种一种子扩大培养一液体深 层通风发酵一过滤一离心一干燥一粗酶制剂一酶活测定 配方：斜面种子培养基：蔗糖30g硫酸铵3g磷酸 氢钾lg硫酸镁0．5g硫酸铁0．Olg水1000ml琼脂2％ 液体摇瓶扩大培养基：玉米面4％。豆饼粉3％ 麦麸1％ Kel O．5g水lO00ml 自然PI-I通风 恒温液体深层通风发酵培养基：玉米粉10％ 豆饼 粉4％ 麦麸l％ 水lO00ml PH4．5 1．粗酶提取 发酵液一过滤一盐析一固形物一烘干一加入淀粉添 充剂一磨粉一粗酶制剂。 2．酶活力测定 酶活力测定方法 (一)钢圈法：5ml 3％ 琼脂倒皿一再加5ml 可溶性淀粉与3％ 琼脂一放入三个灭过菌的钢圈分 别滴人不同浓度的酶液一定期测定透明圈直径。 (二)比色法：lOml 20％ 可溶性淀粉 5ml柠 檬酸PH4．8 (对照不加酶液。处理加lm1) 加lml 10％NaOH终止反应，对照补加lml酶液一滤纸过渡一 比色。 四、结果 与分析 （一）结果 1．钢圈实验结果如下表： 2．DNS测定结果如下表 (二)分析 用液体深层发酵生产糖化酶，由于黑曲霉具很强的抗污染力，生产力强，易培养，所以菌种培养条件一般很好控制，不会受到污染，而发酵条件难以控制。这正是提高酶活的关键。据中科院研究认为，酶的形成时刻与培养时间无关，而与培养基的PH变化有关，只有当PH从3．0回升时才能开始检测出酶活力，PH回升到4．5以后酶开