大肠杆菌基因组dna提取及荧光定量pcr试验设计.docxVIP

PAGE / NUMPAGES 大肠杆菌基因组DNA的提取 一、传统法提取大肠杆菌基因组DNA。 1、实验原理 提取DNA的一般过程是将分散好的组织细胞在含十二烷基硫酸钠（SDS）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质，再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质，得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。 SDS的作用机理是由于其能结合蛋白，中和蛋白的电性，使蛋白质的非共价键受到破坏，失去二级结构，从而变形失活，蛋白酶K或链霉蛋白酶E均为光谱蛋白酶，其重要特性是能在SDS和EDTA（乙二胺四乙酸二钠）存在的情况下保持很高的活性。在匀浆后提取DNA的反应体系中，SDS可通过失活蛋白破坏细胞膜、核膜，并使组织蛋白和DNA分离；而蛋白酶K可将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使DNA分子完整地分离出来。用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，最后用无水乙醇沉淀DNA。为获得高纯度DNA，操作过程中常加入RNaseA除去RNA。CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶液中（0.7 mol/L NaCl）是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定的程度（0.3 mol/L NaCl）时，从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白，多糖物质分开。最后通过乙醇或异丙醇沉淀DNA，而CTAB溶于乙醇或异丙醇而除去。 2、实验试剂与仪器 1）实验材料：大肠杆菌 2）实验试剂： LB液体培养基，TE溶液，10%SDS，蛋白酶K，5mol/L NaCl，?CTAB/NaCl溶液，酚/氯仿/异戊醇，异丙醇，70%乙醇 3）实验仪器：恒温摇床、低温离心机、微量移液器、水浴锅 3、溶液配制 1）LB液体培养基：细菌培养用胶化蛋白胨10 g/L，细菌培养用酵母提取物5 g/L，NaCl 10g/L，去离子水。 (搅拌溶解后，用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容100ml，用20/50ml摇瓶分装5瓶，包扎好，在121℃，1.034×105 pa高压下蒸汽灭菌20min.) 2）TE缓冲液： 1M Tris 溶液（取Tris242.2g，加ddH2O至1600ml，加热溶解） 1M tris-HCl pH8.0 溶液（取 1M Tris 溶液160ml用分析纯盐酸调至Ph=8.0（需浓盐酸约8.5ml），加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用）? TE缓冲液（10 mM Tris-HCl 1Mm EDTA pH=8.0，1M Tris-HCl Buffer PH=8.0 5ml 0.5M EDTA PH =8.0 1ml向烧杯中加入约400mldd H2O均匀混合;将溶液定容到500ml后，高温高压灭菌，室温保存） 3）蛋白酶K：（20mg蛋白酶K溶于1ml无菌双蒸水，-20℃备用） 4）CTAB/NaCl溶液：（5% w/v，5gCTAB溶于100ml 0.5M NaCl溶液中，需加热到65℃使之溶解，然后室温保存） 4、实验方法步骤 1、将大肠杆菌接种到灭菌好的LB培养基中，一级培养过夜，以10%的接种量进行二级培养，培养至对数期（4-6h）。 2、取菌液1.5ml置于离心管中，以5000rpm冷冻离心1min，弃上清液 3、加190 ul TE悬浮沉淀，并加10 ul 10%SDS,摇匀直至溶液变粘稠 4、加入1ul蛋白酶K（20mg/ml），混匀，37℃保温1小时。 5、加30ul 5 mol/L NaCl,混匀。 6、加30ul CTAB/NaCl溶液，混匀，65℃保温20min 7、加入300ul酚/氯仿/异戊醇抽提（25：24:1），5000rmp离心10min 8、取上清液，加入300ul氯仿/异戊醇（24:1）抽提，5000rmp离心10min 9、取上清液，加入300ul的异丙醇，颠倒混匀，室温下静止10min，沉淀DNA，5000rmp离心10min 10、加500ul 70%乙醇洗沉淀，5000rmp离心10min 11、弃上清液，待酒精挥发尽后加30ulTE溶解 12、溶解于20ul TE中，-20℃保存。 二、试剂盒法提取大肠杆菌基因组DNA。 细菌基因组DNA提取试剂盒： 1、TGuide细菌基因组DNA提取试剂盒 DP302-02 50次 420元 2、TaKaRa细菌基因组DNA小量纯化试剂盒 TaKaRa ?DV810A 50 650元 3、Biomiga 细菌基因组DNA提取试剂盒 GD2411-01 Bacterial gDNA kit 50次 423元 GD2411-02 Bacterial gDNA kit 250次 1798元 4、Biospin 细菌基因组 DNA 提取试剂盒 BSC12S1 50次 400元 BSC1