SDS-PAGE操作方法要点.docVIP

PAGE \* MERGEFORMAT PAGE \* MERGEFORMAT 9 SDS教程 1 SDS原理 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）， SDS会与变性的多肽，并使蛋白带负电荷，由于多肽结合SDS的量几乎总是与多肽的分子量成正比而与其序列无关，因此SDS多肽复合物在丙稀酰胺凝胶电泳中的迁移率只与多肽的大小有关，在达到饱和的状态下，每克多肽可与1.4 g去污剂结合。当分子量在15 KDa到200 KDa之间时，蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系，符合下式：log MW = K – bX，式中：MW为分子量，X为迁移率，k、b均为常数，若将已知分子量的标准蛋白质的迁移率对分子量对数作图，可获得一条标准曲线，未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得分子量。 SDS[Laemmli法] 这种方法帖出来，大家是不是感觉非常的陌生呢？其实这种发方法很普遍，现在大部分的实验室都是用Laemmli法跑电泳的。如今实验室中用的最多的蛋白电泳是源于Laemmli于1970年发表在nature上的一篇文章中的方法，这篇文章很特别,不仅被引用的次数较多，而且该篇并不是专门阐述蛋白电泳方法上的提出和改进问题，而是对噬菌体头部包装过程中的蛋白进行分析过程中用到电泳分析方法而已，所以阐述如何操作的文字只有那么一小段（但相当经典），这是SDS（不连续系统）的首次成功应用。现在我们在实验室进行的SDS试剂的配方仍然是沿用了它的数据,许多论文在描述其SDS时引用Laemmli方法，目前常用的具有浓缩胶和分离胶的不连续SDS的基础的确来自Laemmli方法，但也略有差别例如一些缓冲液的具体组成。你也许会恍然大悟：原来我们用的就是Laemmli！ SDS各试剂配制方法 30%聚丙烯酰胺溶液30%（w/v）Acrylamide 【组分浓度】 各种组分名称 体积(mL)或质量(g) 备注 30%Acr-Bis(29:1) 100 mL 实验室配制时用量(100 mL) 29% Acrylamide(丙烯酰胺) 29 g 29.2 g 1% BIS(N,N’-亚甲丙烯酰胺) 1 g 0.8 g 【配制方法】 将29克丙烯酰胺和1克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml温热（37℃左右）的去离子水中，充分搅拌溶解，补加水至终体积为100ml。0.45μm微孔滤膜过滤除菌和杂质，储于棕色瓶，4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存。严格核实pH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。 【保存条件】 4℃避光（用铝箔纸包扎起来）保存【注意事项】 丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收，其作用具有累积性。称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能含有少量未聚合材料。 1 M Tris-HCl（pH6.8）(浓缩胶buffer) 【组分浓度】1 M Tris-HCl 名称 用量 备注 Tris 12.1g 去离子水 80ml 浓盐酸 9ml (36%的浓盐酸)预实验已确定 去离子水 加入去离子水定容至100ml后，室温保存 【配制方法】 称量12.1 g Tris碱溶于80 mL的去离子水，充分搅拌溶解，加约9 mL的浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 【保存条件】 室温保存。 【注意事项】 对人体有刺激性，请注意适当防护。 1.5 M Tris-HCl（pH 8.8）(分离胶buffer) 【组分浓度】1.5 M Tris-HCl 名称 用量 备注 Tris 18.17 g 去离子水 80 mL 浓盐酸 3 mL (36%的浓盐酸)预实验已确定 去离子水 加入去离子水定容至100 mL后，室温保存 【配制方法】100 mL 称量18.17 g Tris碱溶于80 mL的去离子水中，充分搅拌溶解，加约3 mL浓HCl调节至所需要的pH值，将溶液定容至100 mL，高温高压灭菌后，室温保存。 【保存条件】 室温保存 【注意事项】 应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。 10% 十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS 【组分浓度】10% (w/v) SDS 名称 用量 备注 SDS 1 g 去离子水 8 mL 加入去离子水定容至10 ml后，室温保存 【配制方