家蚕蚕蛾毛结构蛋白的鉴定-生理学专业论文.docxVIP

Dissertation Dissertation for Master’S Degree of S outhwest University Identification of structural proteins in the scale of silkworm，Bombyx mori Major Physiology Field Animal Molecular Physiology Sul Prof．Ningi’HeSupervisor P NmKl la He Candidate Li Peng Chongqing China May,2011 独创性声明本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。 位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 在文中作了 示衷心感谢。 学位论文作 签字日期：沙力年‘月≥ 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院(筹)可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 (必威体育官网网址的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：r-1不必威体育官网网址，口 导师签名：呵讥 签字日期：扩lc年‘月≥日 签字日期：例年易月弓日 摘要ILl 摘要 ILl i舅 家蚕蚕蛾鳞毛结构蛋白的鉴定 生理学专业硕士研究生李鹏 指导老师何宁佳教授 摘要 鳞翅目昆虫是威胁农业生产的最大害虫类群，为减少其对农业生产的危害， 人们每年使用大量化学农药以控制害虫数量。但化学农药的滥用，不但对环境造 成污染，威胁人们的健康，而且在消灭害虫的同时也对非靶标生物产生了不良影 响。 鳞翅目昆虫翅面具有色彩斑斓的图案，其翅面的鳞毛是鳞翅目昆虫区别于其 它生物的典型特征，也是鳞翅目昆虫伪装和拟态的主要构成要件。鳞毛由表皮的 毛原细胞形成，是一种具有精细结构的表皮衍生物。鳞毛具有调节温度的功能， 增加了虫体对环境温度的适应性。鳞毛精密结构与光线相互作用，从而产生了结 构色，人们对结构色的产生机理做了大量研究，但其机理仍然有待研究。 家蚕(Bombyx mori)具有详尽的基因组数据信息，是鳞翅目昆虫研究的模式 生物。因此，本论文从分子生物学的角度着手，以家蚕(Bombyx肌D一)成虫鳞毛 为研究对象，利用家蚕基因组数据库、EST数据库和表达芯片数据库，采用SDS 抽提和胰蛋白酶直接消化相结合的蛋白提取方法，利用LC．MS／MS调查了家蚕鳞 毛的蛋白质构成。另外，采用RNAi技术，研究了部分表皮蛋白基因对家蚕鳞毛表 型的影响，获得以下主要结果： 1．家蚕鳞毛的蛋白质构成 本研究采用SDS抽提和胰蛋白酶直接消化相结合的方法，提取家蚕(Bombyx mori)，成虫鳞毛蛋白质，并利用LC-MS／MS对所获得的肽段进行了鉴定，进而将 在鳞毛中发现的175个肽段与基于由silkDB、家蚕eDNA数据库以及NCBI构建 的本地数据库进行比对，总共鉴定获得40个蛋白。其中包括7个不可溶性表皮蛋‘．． 白，它们是通过使用胰蛋白酶直接消化SDS抽提后剩余的沉淀所获得的，首次在 鳞毛中发现表皮蛋白。这些表皮蛋白中有一半以上是属于BmCPG蛋白家族。而在 SDS抽提的蛋白中，发现31个非表皮蛋白，他们分属于9类蛋白质：(1)肌肉蛋 白，(2)蛋白酶与抑制剂，(3)转运蛋白，(4)新陈代谢与糖代谢相关蛋白，(5) 蛋白分泌相关蛋白，(6)热激蛋白，(7)氧化还原相关蛋白，(8)储存蛋白，(9) 其它类的蛋白质。 在蛹期对家蚕蛹注射siRNA，通过RNA干涉研究家蚕鳞毛表皮蛋白基因的功能。 在蛹期对家蚕蛹注射siRNA，通过RNA干涉研究家蚕鳞毛表皮蛋白基因的功能。 结果表明，注射了siRNA的家蚕羽化后，在表型上未能发现明显差异。采用实时 定量PCR检测了RNAi后家蚕四个表皮蛋白基因BmCPGl、BmCPR2、BmCPR63、 BmCPGll的表达水平，结果与对照(注射EGFPsiRNA)相比均有不同程度的下 降，这表明所注射siRNA干扰了家蚕表皮蛋白基因的正常表达。随后我们用扫描 电子显微镜(SEM)观察了RNAi后家蚕鳞毛及鳞片臼的表型变化，结果表明， 与对照组鳞毛相比，RNAi后家蚕鳞毛的脊脉宽度和间距都有减小的趋势，同时鳞 片臼的密度和直径也有减小的趋势。我们推测家蚕鳞毛表皮蛋白基因表达量的降 低导致表皮蛋白的合成减少，进而使得毛原细胞没有足够的材料来完成鳞毛的构 建。特别是