内毒素光度测定法检查技术.pptVIP

* Page * Http:// 试验完成后进行数据分析 * Page * Http:// 试验完成后进行数据分析 E0.3125 E0.25 E2 3 ）干扰初筛试验 目的及原理 只有在无干扰情况下，样品的内毒素检测结果才是有效的。 通过检测从供试品原液到其MVD或MVC之间的稀释液，计算内毒素回收率，判断供试品浓度对BET的干扰情况。 * Page * Http:// 试验步骤 1、供试品限值的确定 2、试剂的选择 3、供试品最大有效稀释的计算 4、反应溶液的制备 5、加样及反应 6、结果判断 * Page * Http:// 干扰初筛试验举例 供试品限值 硫酸庆大霉素，100ml/瓶，5000U/ml； 药典要求，硫酸庆大霉素限值L=0.5EU/1000U * Page * Http:// 试剂 本试验使用鲎试剂的检测范围为10~0.03EU/ml，选择标准曲线浓度为2、0.25、0.03EU/ml * Page * Http:// 试剂名称 厂家 装量 规格 动态浊度法TAL 安度斯 1.25ml/支 10~0.03EU/ml 内毒素标准品（CSE） 安度斯 10ng/支 10EU/ng（CoA） BET水（W） 安度斯 25ml/瓶 内毒素0.003EU/ml 最大有效稀释倍数的计算 光度测定法中，供试品最大有效稀释倍数计算公式： MVD=cL/λ，其中λ为标准曲线最低点浓度 本试验， * Page * Http:// MVD= 5000U/ml x 0.5EU/1000U 0.03EU/ml =80（倍） 各反应溶液的制备 溶液C的制备 E100 0.4ml 3.6ml W E10 0.8ml 3.2ml W E2 0.4ml 2.8ml W E0.25 S原液 0.4ml 3.6ml W S10 1.4ml 1.4ml W S20 1.4ml 1.4ml W S40 1.4ml 1.4ml W S80 备用液 0.4ml 2.8ml W E0.03 溶液A的制备 E0.5 0.8ml 2.4ml W 备用液 * Page * Http:// 溶液B的制备 E0.5 S10 0.5ml 0.5ml S20 E0.25 E0.5 S40 0.5ml 0.5ml S80 E0.25 E0.5 S20 0.5ml 0.5ml S40 E0.25 * Page * Http:// 加样及反应 取TAL两支，参照标准曲线可靠性试验中的方法将其复溶； 复溶鲎试剂后，运行软件，使其进入待采集状态； 将两支复溶好的鲎试剂溶液合并在一起，轻轻混匀避免产生气泡； 将鲎试剂液分装至20支反应试管中，0.1ml/管； 将相应的溶液A、B、C、D加至反应管中，0.1mL/管，每浓度平行2管 E0.03 E0.25 E2 溶液C 溶液D W S20 S40 S80 S20E0. 25 S40E0. 25 S80E0. 25 溶液A 溶液A 溶液A 溶液B 溶液B 溶液B * Page * Http:// 结果判断 药典要求 1、阴性对照的反应时间（TD ）大于标准曲线最低浓度的反应时间（Tλ） 2、标准曲线的相关系数|r|≥0.980 3、回收率R满足：50% ≤R ≤200% 厂家建议值 4、变异系数CV%10% * Page * Http:// 回收率的计算 光度测定法试验中，在供试品检查浓度的溶液中,添加标准曲线中点或靠近中点的内毒素浓度,根据回收的内毒素浓度与添加的内毒素浓度的比值(回收率R)，判断供试品溶液对试验的干扰程度。R的计算公式如下： * Http:// Page * Ct：试验测出的供试品溶液的内毒素含量 Cs ：试验测出的加入? m标准内毒素的供试品溶液的内毒素含量 ? m：标准曲线的中点或靠近中点的已知浓度内毒素 光度测定法规定：当R在50~200%之间时，认为在此试验条件下该供试品溶液对试验无干扰。 Cs-Ct ? m R= 本试验结果 * Page * Http:// 相关系数绝对值|r|=0.99490.980 TD（3600s）Tλ 20倍回收率 40倍回收率 80倍回收率 试验有效 试验有效 有干扰 有干扰 无干扰 4）干扰试验 根据干扰初筛试验结果，确定选择供试品的无干扰浓度 选择3批供试品进行干扰验证试验 溶液的制备方法与干扰初筛试验相同 * Page * Http:// 有干扰 不理想 无干扰 溶液的制备 A为稀释倍数不超过MVD的供试品溶液B为加入?m内毒素且与A溶液有相同稀释倍数的供试品溶液C为用于制备标准曲线的内毒素标准溶液D为阴性对照 编号 内毒素浓度 配制内毒素的溶液 平行管数 A 无 供试品溶液 不少于2个 B 标准曲线的中点（或附近点）的浓度（设为λm） 供试